單克隆抗體nj001-1在制備抑制nsclc侵襲及轉移的藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物藥物領域，涉及單克隆抗體NJ001-1在制備抑制NSCLC侵襲及轉 移中的應用。
【背景技術】
[0002] 肺癌的侵襲與轉移是其惡性標志和特征，也是影響肺癌患者治療效果和導致患 者死亡的最主要原因。肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（Non-small-cell Lung Cancer，NSCLC)，其中NSCLC約占85%，NSCLC中又以肺腺癌最為常見。NSCLC起病隱匿，發 展迅速，預后差，不治療者的中位生存期僅為4~5個月，1年生存率為10%左右，5年生存 率不足5%。多數NSCLC患者在臨床初診時已出現遠處轉移（IV期），化療藥物治療效果很 不理想。目前，非小細胞肺癌細胞發生轉移的分子機制尚未完全闡明，而臨床上也缺乏特異 性高、針對性強的抑制肺癌細胞轉移的治療藥物。因此，探索肺癌侵襲轉移的分子機制，尋 找并開發治療肺癌侵襲轉移的有效藥物與治療途徑，是肺癌分子生物學研究的關鍵所在。
[0003] 腫瘤的侵襲轉移是一個多步驟、多階段、多途徑、涉及多基因變化的復雜過程。有 研究表明，在癌細胞侵襲和轉移過程中多個信號通路可以被激活，如RAS/MAPK通路，Akt/ PI3K通路和ERK通路等，從而使細胞產生腫瘤細胞的生物特征和行為。通常情況下，腫瘤 侵襲和轉移是一個主動的過程，需腫瘤細胞與腫瘤機制成分共同參與，常包括三個步驟：月中 瘤細胞與細胞外基質的黏附；腫瘤細胞釋放或誘導釋放多種蛋白水解酶，降解細胞外基質； 降解區域的腫瘤細胞在趨化因子的引導下轉移，在此基礎上腫瘤細胞于靶標組織中誘導血 管形成，對抗宿主抗腫瘤免疫，最終在遠處形成轉移灶。
[0004] 金屬蛋白酶組織抑制因子-3 (??ΜΡ-3)是一種結合細胞外基質（ECM)的非可溶性 蛋白。??ΜΡ-3參與正常組織的發育和重建過程，也參與了許多疾病的發生。??ΜΡ-3-方面 可以刺激成纖維細胞增殖，另一方面卻誘導惡性腫瘤細胞的凋亡。由于??ΜΡ-3能以I : 1 分子比例與基質金屬蛋白酶（MMPs)非共價結合，抑制MMPs的活性，因此??ΜΡ-3有抑制腫 瘤生長、侵襲和轉移的作用，腫瘤組織中??ΜΡ-3表達水平的下調或丟失將促進腫瘤的進 程。由此可見，基質金屬蛋白酶（MMPs)及其抑制劑（??ΜΡ)是調控非小細胞肺癌侵襲轉移 能力的關鍵因子。
[0005] 惡性腫瘤細胞從原發部位經淋巴、血液、體腔等途徑播散到其他部位的過程為腫 瘤的轉移。惡性腫瘤細胞的轉移是其區別于正常細胞的特征之一，是其本身的生物學特 征。腫瘤的轉移是其危及宿主生命及影響治療效果的主要原因。惡性腫瘤細胞能夠轉移，其 原因在于它與正常細胞具有諸多方面的不同，如：生長調控機制的喪失、質膜流動性改變、 細胞運動能力的改變、細胞異型性增加、粘附性改變、細胞極性改變等。在不同的腫瘤，其細 胞特性不完全相同，因此其轉移能力也不相同，即使在同一瘤體內，也可能存在具有不同轉 移潛能的細胞亞群。目前抗轉移藥物的研究主要針對腫瘤轉移的機理以及轉移過程中腫瘤 細胞、機體組織的各種變化進行了多方面的研究，但由于腫瘤轉移本身的多變性、復雜性， 影響因素的多樣性，以及研究手段的限制，到目前為止，尚未發現確切的可以控制惡性腫瘤 轉移動藥物。
[0006] 目前，應用于臨床的抗腫瘤藥物雖然能在一定程度上抑制腫瘤生長，促進腫瘤細 胞凋亡，然而對腫瘤細胞的侵襲和轉移并無顯著的抑制作用。腫瘤細胞的凋亡和侵襲轉移 是分子機制不同的兩個病理生理過程。調控細胞凋亡的途徑主要包括線粒體途徑、內質網 途徑和死亡受體途徑。然而，腫瘤細胞侵襲轉移大多與基質金屬蛋白酶及其抑制物的基因 表達、上皮間質化等相關。以臨床應用的鉑類抗腫瘤藥物-順鉑、卡鉑等為例，雖然鉑類藥 物能顯著抑制腫瘤增殖，抗癌譜較廣，但其無法抑制腫瘤的侵襲和轉移。因此，能夠促進腫 瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長的藥物或抗體并不一定能夠用于抑制腫瘤侵襲與轉移。開發針 對惡性腫瘤轉移的藥物將成為延長腫瘤患者生存時間、提高腫瘤治療效果的重要途徑。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供單克隆抗體NJ001-1在制備抑制 NSCLC侵襲及轉移的藥物中的應用。
[0008] 本發明的目的可通過以下技術方案實現：
[0009] 單克隆抗體NJ001-1在制備抑制NSCLC侵襲及轉移的藥物中的應用。所述的單克 隆抗體NJ001-1由保藏號為CCTCC NO :C201172的雜交瘤細胞株NM001-1分泌。
[0010] 單克隆抗體NJ001-1在抑制NSCLC侵襲及轉移中所作用的關鍵基因作為靶點在制 備抑制NSCLC侵襲及轉移的藥物中的應用。
[0011] 所述的單克隆抗體NJ001-1在抑制NSCLC侵襲及轉移中所作用的關鍵基因優選編 碼轉錄因子FOXPl。
[0012] 本發明所述的單克隆抗體NM001-1的制備方法見CN102391992B。
[0013] 有益效果：
[0014] 單克隆抗體NJ001-1能夠特異性識別位于NSCLC細胞漿與細胞膜上的SP70抗 原，具有誘導NSCLC細胞凋亡的作用，且對腫瘤細胞的侵襲和轉移也存在潛在性影響。單 克隆抗體NJ001-1能有效抑制肺腺癌細胞的迀移（圖1)和侵襲（圖2)，并能顯著增加 HMP-3mRNA和蛋白表達（圖3)。單抗NJ001-1作用下，肺腺癌細胞核內NJ001-1特異性抗 原能與轉錄因子FOXPl結合，抑制其對TIMP-3基因啟動子區的轉錄抑制作用。
【附圖說明】
[0015] 圖1細胞劃痕實驗檢測肺腺癌細胞迀移能力
[0016] A :單抗NJ001-1處理SPC-Al細胞Oh和48h "劃痕"圖；
[0017] B :單抗組與對照組SPC-Al細胞迀移距離比較；
[0018] *單抗組和相應對照組間比較，*Ρ〈0· 05, #Ρ〈0· 01，*#Ρ〈0· 001。
[0019] 圖2 Transwell實驗檢測肺腺癌細胞侵襲能力
[0020] 圖3單抗NJ001-1誘導??ΜΡ-3表達
[0021] 圖4單抗NJ001-1特異性抗原（50kDa)與FOXPl相互作用
[0022] 生物材料樣品的保藏信息
[0023] 雜交瘤細胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中國典型培養物保藏中心，保 藏地址為中國武漢，武漢大學，保藏號為CCTCC NO :C201172。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1
[0025] 1、細胞迀移檢測
[0026] 收集處于對數生長期的肺腺癌細胞SPC-A-I制成單細胞懸液，以2X IO5細胞/孔 加入6孔細胞培養板中，過夜培養，吸棄培養上清，并用Hank's液500 μ 1/孔洗一遍。抗體 組（50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL三組）：每孔加入單抗NJ001-1溶液，終濃度分別為 50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL每孔；對照組（0 μ g/mL):每孔加入20ml培養液。干預 后培養24h和48h，用于細胞迀移檢測。每組設3個平行孔，實驗重復3次。
[0027] 2、細胞迀移能力（劃痕實驗）檢測
[0028] 原理：當細胞長到融合成單層狀態是，在融合的單層細胞上人為制造一個空白區 ±或，稱為"劃痕"（Wound)。劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使"劃痕"愈合（Healing)。 基本的步驟包括"劃痕"的制造，細胞迀移期間圖像的獲得以及后期數據的處理。
[0029] 操作過程：
[0030] (1)將2X IO5細胞/孔加入6孔細胞培養板中，過夜培養，待細胞長到融合狀態。 數量以貼壁后鋪滿板底為宜；
[0031] (2)用消毒后的10 μ 1進口槍頭在洗凈的細胞表面劃出四道相互垂直的"井"字劃 痕；
[0032] (3)吸去細胞培養液，使用PBS緩沖液洗滌細胞3次，洗去劃痕產生的細胞碎片；
[0033] (4)選擇劃痕視野，進行標記，并于顯微鏡下進行觀察拍照；
[0034] (5)將6孔細胞培養板放入細胞培養箱培養，分別于24h和48h后取出拍照；
[0035] (6)劃痕愈合情況以細胞傷口愈合間距與細胞劃痕的間距比例進行計算。
[0036] 結果：
[0037] 50 μ g/mL、100 μ g/mL 和 150 μ g/mL 濃度的單抗 NJ001-1 作用于肺腺癌 SPC-A-I 細 胞48h后，"劃痕"愈合能力降低，即與對照組（未經單抗NJ001-1處理）相比，單抗組劃痕 空白處的距離較寬。通過測量單抗組和對照組Oh和48h的"劃痕"寬度，計算SPC-A-I細胞 迀移距離，比較各組SPC-A-I細胞迀移能力的差異。結果顯示，單抗組SPC-A-I細胞迀移能 力受到不同程度的抑制，其中100 μ g/mL和150 μ g/mL單抗NJ001-1作用于SPC-Al后細胞 迀移能力降低，與對照組相比具有統計學差異（P值均小于〇. 05) ;50 μ g/mL單抗NJ001-1 作用于SPC-Al后細胞迀移距離變小，但與對照組相比無統計學差異。上述結果表明，單抗 NJ001-1能抑制肺腺癌細胞迀移。低劑量單抗NJ001-1對肺腺癌細胞迀移能力的抑制作 用并不明顯，但隨著單抗NJ001-1濃度的增加，肺腺癌細胞的迀移能力逐漸降低，提示單抗 NJ001-1能劑量依賴性的對肺腺癌細胞迀移發揮抑制作用。
[0038] 實施例2
[0039] (1)細胞侵襲檢測
[0040] 收集處于對數生長期的SPC-A-I和A549制成單細胞懸液，以8 X IO4細胞/孔加 入24孔細胞培養板中。抗體組（50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL三組）：每孔外室加入 單抗NJ001-1溶液，終濃度分別為50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL每孔；對照組（0 μ g/ mL):每孔加入500 μ 1培養液。干預后培養24h，用于細胞侵襲檢測。每組設3個平行孔， 實驗重復3次。
[0041] ⑵細胞侵襲能力（Transwell實驗）檢測
[0042] 原理：將transwell小室放入培養板中，小室內稱為上室，培養板內稱為下室，上 室內添加上層培養液，下室內添加下層培養液，上下層培養液以膜相隔。將細胞種在上室 內，由于膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培 養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。選擇不同材料的膜和孔徑，可以進行共培養、細 胞趨化、細胞迀移、細胞侵襲等多種方面的研究。
[0043] 操作過程：
[0044] (1)在Transwell 24孔細胞培養板的小室中加入60 μ 1基質膠（ECM gel)稀釋 液，基質膠與無血清RPMI-1640培養液的稀釋比例為1:9 ;
[0045] (2)將Transwell 24孔細胞培養板放入37 °C細胞培養箱，使基質膠自然凝固；
[0046] (3)將肺腺癌細胞重懸于無血清RPMI-1640培養液，每小室加入I X IO5~I X 10 6細胞（具體因細胞穿透能力不同而改變），上室內無血清RPMI-1640培養液總體積為 200 μ 1 ；
[0047] (4)根據細胞分組，在下室內加入500 μ 1含10% FBS的RPMI-1640培養液，其中 單抗 NJ001-1 的濃度分別為 0