Ipv-dpt疫苗的制作方法
【專利說明】IPV-DPT 疫苗
[0001] 本申請是國際申請日為2007年9月28日的申請號為200780036247. 7的中國發 明專利申請" IPV-DPT疫苗"的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及混合疫苗，尤其是含有滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株（七一匕' y株步 y才少只）（sipv)的混合疫苗以及該混合疫苗的制備方法。
[0003] 發明背景
[0004] 脊髓灰質炎是脊髓灰質炎病毒引發的傳染病。對于人而言，脊髓灰質炎病毒是經 口感染，并在腸道增殖，經血液進入中樞神經系統的。進入中樞神經系統的脊髓灰質炎病毒 通過在大型運動神經細胞中增殖，引起運動神經細胞變性、壞死，導致四肢發生急性弛緩性 麻痹。此外，脊髓灰質炎病毒侵入延髓的呼吸中樞時，有時因呼吸麻痹而致死。為了抑制引 發這些危重癥狀的脊髓灰質炎的發病，脊髓灰質炎疫苗廣為使用。
[0005] 可使用2種脊髓灰質炎疫苗：口服活脊髓灰質炎疫苗和滅活的脊髓灰質炎疫苗。 口服活脊髓灰質炎疫苗是使用脊髓灰質炎病毒的弱毒株（沙賓株）的疫苗。口服給藥的脊 髓灰質炎病毒弱毒株引發通常的感染。口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰質炎病毒在人 腸道大量增殖，其結果，在腸道局部形成免疫。另外，口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰 質炎病毒進入血液中，通過引發病毒血癥促進血中抗體的產生。但是由于脊髓灰質炎病毒 弱毒株在中樞神經系統的增殖能力非常弱，通常不引起麻痹。此外，于被接種者的體內，在 接種后約4~6周，口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰質炎病毒增殖，經排泄物排出。該 排出的病毒感染被接種者周圍對脊髓灰質炎免疫弱或無免疫的人，則與被接種者的情況相 同，顯示出賦予免疫或增強免疫的效果。
[0006] 但口服活脊髓灰質炎疫苗來源的脊髓灰質炎病毒弱毒株在被接種者體內反復增 殖期間，或在被所述排出的病毒感染的人的體內反復增殖期間，有時發生向強毒性轉化的 變異。在極少數情況下，該突變株導致疫苗相關的麻痹。
[0007] 滅活的脊髓灰質炎疫苗是將脊髓灰質炎病毒經福爾馬林滅活，失去感染力的 疫苗。由于滅活的脊髓灰質炎疫苗不在被接種者體內增殖、不感染被接種者周圍的 人，不會導致疫苗相關的麻痹。制備滅活的脊髓灰質炎疫苗時，以往使用強毒株，近 年來逐漸開發了 弱毒株（沙賓株）出1〇1(^"318 34(2006) 151-154,06￥811.83861· Karger, 2001，vol. 105, pp 163-169,臨床和病毒 Vol. 30Ν〇· 5 (2002. 12) 336-343)。認為存在 下述缺點：弱毒株（沙賓株）的增殖性稍弱于強毒株的增殖性。
[0008] 含有百日咳菌的保護性抗原（防御抗原）、白喉類毒素（7亍y 7卜年y彳 卜'')、以及破傷風類毒素（破傷風卜? 4 F )的疫苗作為百日咳白喉破傷風混合疫苗而廣 泛使用。
[0009] 已知由無細胞性百日咳疫苗、白喉類毒素、破傷風類毒素以及滅活的脊髓灰質炎 病毒構成的多價疫苗（特表2000-504032號公報）。
[0010] Vero細胞是綠猴腎臟來源的傳代細胞，對各種病毒具有寬范圍的敏感性， 廣泛用于病毒培養。文獻公開了培養腸道病毒71疫苗的制備方法，該方法包括在 微載體7-）上培養Vero細胞，用所培養的Vero細胞使培養腸 道病毒 71 增殖（Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71vaccine development:Suh-Chin Wuj etc. , Vacci ne，22, 3858-3864, 2004)。文獻還公開了使用微載體的通常的細胞培養條件（Microcarrier cell culture principles&methods:Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988)〇
【發明內容】
[0011] 在上述情況下，期望一種包括制備高效價的脊髓灰質炎病毒沙賓株的步驟，制備 含有滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株（sIPV)和百日咳菌的保護性抗原、白喉類毒素、以及破 傷風類毒素（DPT)的混合疫苗的方法。
[0012] 為了解決上述問題，本發明者們經過潛心研究，結果發現通過在約4g/L~約6g/L 的微載體存在下，培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞，可以制備高效價的脊髓 灰質炎病毒沙賓株。基于這些發現，進行了反復研究，結果完成了本發明。
[0013] SP，本發明提供：
[0014] (1) -種混合疫苗的制備方法，所述混合疫苗含有
[0015] ㈧滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株、
[0016] (B)百日咳菌的保護性抗原、
[0017] (C)白喉類毒素、以及
[0018] (D)破傷風類毒素，
[0019] 該方法包括下述步驟：
[0020] (a)在約4g/L~約6g/L的微載體存在下，培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的 Vero細胞。
[0021] (2)上述（1)所述的方法，其還包括下述步驟：
[0022] (b)使脊髓灰質炎病毒沙賓株感染所述Vero細胞的步驟，
[0023] (C)使該脊髓灰質炎病毒增殖的步驟，
[0024] (d)回收含有該脊髓灰質炎病毒的病毒液的步驟，以及
[0025] (e)滅活該脊髓灰質炎病毒的步驟。
[0026] (3)上述⑴所述的方法，其中，所述微載體的濃度為約5g/L。
[0027] (4)上述⑴所述的方法，其中，所述微載體為葡聚糖制微載體。
[0028] (5)上述（1)所述的方法，其中，使Vero細胞增殖的步驟（步驟（a))以約3L以上 的規模進行。
[0029] (6)上述（1)所述的方法，其中，使Vero細胞增殖的步驟（步驟（a))以約30L以 上的規模進行。
[0030] (7)上述（2)所述的方法還包括（d-2)將所述病毒液進行純化的步驟。
[0031] (8)上述（7)所述的方法，其中，所述純化步驟（步驟（d-2))包括下述步驟：
[0032] (i)將經所述步驟（d)回收的病毒液通過超離心進行沉淀（乂 U y卜）化、
[0033] (ii)將該沉淀的重懸液進行超聲波處理、
[0034] (iii)經柱色譜純化。
[0035] (9)上述（8)所述的方法，其中，所述（iii)經柱色譜純化的步驟只進行1次。
[0036] (10)以上述⑴所述方法制備的疫苗。
[0037] (11)上述（1)所述的方法，其中，培養Vero細胞的步驟（步驟（a))以約3L以上 的規模進行。
[0038] (12)上述（1)所述的方法，其中，培養Vero細胞的步驟（步驟（a))以約30L以上 的規模進行。
[0039] 通過在約4g/L~約6g/L的微載體存在下，培養待接種脊髓灰質炎病毒沙賓株的 Vero細胞，可以得到高效價的脊髓灰質炎病毒沙賓株。通過使用高效價的脊髓灰質炎病毒 沙賓株，可以高效地制備滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株。于是，包括下述步驟的混合疫苗的 制備方法（本發明的制備方法）作為制備含有滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株的混合疫苗的 高效制備方法是很有用的，所述步驟為在約4g/L~約6g/L的微載體存在下，培養待接種脊 髓灰質炎病毒沙賓株的Vero細胞。
【附圖說明】
[0040] 圖1表示經微載體法培養Vero細胞時，Vero細胞的增殖曲線圖。3L表示初始細 胞數約為2xl05細胞/mL (低濃度），和3g/L的微載體。3H表示初始細胞數約為10x10 5細 胞/mL (高濃度），和3g/L的微載體。5L表示初始細胞數約為2xl05細胞/mL (低濃度），和 5g/L的微載體。5H表示初始細胞數約為IOxlO5細胞/mL (高濃度），和5g/L的微載體。
[0041] 圖2為表示用在各種條件下培養的Vero細胞得到的I型脊髓灰質炎病毒的感染 滴度（感染価）（病毒效價）的圖。3L表示初始細胞數約為2xl05細胞/mL (低濃度），用 3g/L的微載體培養的Vero細胞得到的I型脊髓灰質炎病毒。5L表示初始細胞數約2xl05細胞/mL(低濃度），用5g/L的微載體培養的Vero細胞得到的I型脊髓灰質炎病毒。5H表 示初始細胞數約IOxlO5細胞/mL (高濃度），用5g/L的微載體培養的Vero細胞得到的I型 脊髓灰質炎病毒。Ref.表示用綠猴腎臟細胞增殖的I型脊髓灰質炎病毒。
[0042] 本發明提供下述混合疫苗的制備方法，該方法包括可制備高效價的脊髓灰質炎病 毒沙賓株的步驟，所述混合疫苗包含滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株（SlPV)和百日咳菌的 保護性抗原、白喉類毒素、以及破傷風類毒素（DPT)。
[0043] 以下，對本發明進行詳細說明。
[0044] 1.滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株
[0045] (1)脊髓灰質炎病毒沙賓株
[0046] 在本說明書中，脊髓灰質炎病毒沙賓株是指來源于艾伯特B.沙賓博士（Dr. Albert B. Sabin)分咼的脊髓灰質炎病毒的弱毒株的脊髓灰質炎病毒株（參照Sabin AB,Boulger LR. History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains. J. Biol. Standard 1973, 1，115-118 等）〇
[0047] 脊髓灰質炎病毒沙賓株中包括脊髓灰質炎病毒沙賓I型株、脊髓灰質炎病毒沙賓 II型株以及脊髓灰質炎病毒沙賓III型株。作為脊髓灰質炎病毒沙賓I型株，可以列舉， LSc、2ab株等。作為脊髓灰質炎病毒沙賓II型株，可以列舉，P712、Ch、2ab株等。作為脊髓 灰質炎病毒沙賓III型株，可以列舉，Leon，12aib株等。
[0048] (2)滅活
[0049] 在本說明書中，病毒的"滅活"是指使病毒失去感染能力。作為滅活的方法，可以 列舉，使用物理方法（例如，使用X射線照射、熱、超聲波等的方法）、化學方法（例如，使用 福爾馬林、汞、乙醇、氯等的方法）等，但并不限于這些方法。
[0050] 脊髓灰質炎病毒的滅活可用公知的方法進行（例如，參照Biologicals 34(2006) 151-154等）。具體來講，例如，可通過將脊髓灰質炎病毒用福爾馬林處理進行滅 活。
[0051] (3)滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株的免疫原性
[0052] 滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株中通常混合存在被稱為D抗原以及C抗原的2種病 毒抗原。D抗原為完全病毒粒子。D抗原對應的抗體具有中和活病毒的感染性的能力，作為 保護性抗體（防御抗體）發揮作用。C抗原被稱為缺損粒子，是完整病毒粒子缺失核心核酸 RNA和部分病毒蛋白的粒子，是中空狀粒子。C抗原對應的抗體無中和活病毒的感染性的能 力，即使有該能力也是非常低的。因此，將滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株作為疫苗使用時， D抗原是必要的。
[0053] 脊髓灰質炎病毒包括I型、II型、III型3種類型。對感染脊髓灰質炎病毒的免 疫，對于I型、II型、III型3種病毒型是特異的，即使存在型間交差免疫也很微弱。I型、 II型以及III型滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的D抗原具有可產生下述中和抗體的免疫原 性，所述中和抗體為分別對應于脊髓灰質炎病毒的I型、II型以及III型野生株（強毒株） 的中和抗體。滅活脊髓灰質炎病毒沙賓株的D抗原對I型、II型以及III型分別具有不同 的免疫原性，為了產生足夠的抗體用于中和脊髓灰質炎病毒的I型、II型以及III型的野 生株（強毒株），所必需的D抗原量因病毒型而異。
[0054] 如上所述，脊髓灰質炎病毒包括I型、II型、III型3種類型，無論哪種類型都引 發相同的脊髓灰質炎。因此，將滅活的脊髓灰質炎病毒沙賓株作為疫苗（滅活的脊髓灰質 炎疫苗）使用時，必需具有可產生足夠中和I型、II型以及III型各野生株（強毒株）的 脊髓灰質炎病毒抗體的免疫原性，此外，優選與以往使用的強毒株來源的滅活脊髓灰質炎 疫苗的免疫原性接近的免疫原性。為了表現出該免疫原性，以D抗原量計，優選疫苗含有I