一種以殼寡糖為佐劑負載大腸桿菌菌毛黏附素的鴨疫里默氏菌菌影疫苗的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于家禽養殖疫病防控領域，涉及一種細菌疫苗的制備方法，尤其是涉及 一種以殼寡糖為佐劑攜帶大腸桿菌I型菌毛黏附素亞單位的鴨疫里默氏菌菌影疫苗的制 備方法。
【背景技術】
[0002] 鴨傳染性衆膜炎，是由鴨疫里默氏菌（iipes ii/kr, RA )引起的 鴨、鵝、火雞及其它家禽和野禽的一種急性或慢性接觸性傳染病，主要侵害2-7周齡雛鴨， 以神經癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。臨床實踐中，鴨疫里默氏菌常常與 大腸桿菌形成混合感染，導致很高的病死率。
[0003] 傳統上對鴨傳染性漿膜炎和大腸桿菌的防控以抗生素為主，但隨著臨床用藥的種 類、數量及頻次的增加，耐藥性日益普遍，而且由此導致的禽產品的藥物殘留問題也日益突 出。因而，防控該病的科學方法，是在強化飼養管理的基礎上，免疫接種合適的鴨疫里默氏 菌疫苗。
[0004] 目前，關于鴨疫里默氏菌的免疫防控方面已經有了許多研究報道。例如，鴨疫里默 氏菌滅活苗、二價復合佐劑滅活疫苗等。鴨疫里默氏菌血清型眾多，不同血清型之間缺乏交 叉保護，細菌滅活過程中有可能改變抗原結構而降低免疫原性。另一方面，滅活苗僅僅誘發 機體的體液免疫。而局部的黏膜抗體（SIgA)是抵御病原感染的第一道防線。革蘭陰性菌 被噬菌體PhiX174的裂解基因 E裂解后形成細菌空殼，但仍保持完整的細菌細胞形態、細 菌表面抗原等特性，稱為菌影或菌銳（bacteriaL ghost, BG)，是細菌疫苗發展的一個新方 向。目前，鴨疫里默氏菌菌影疫苗也有一些初步的研究報道，與油佐劑配合證實可以激發較 強的體液免疫反應。但由于菌影失去了繁殖能力，如果進行消化道或呼吸道接種免疫，菌影 不容易附著。所以，目前所報道的鴨疫里默氏菌菌影疫苗仍是通過注射免疫途徑。
【發明內容】
[0005] 鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種利用噬菌體PhiX174的E基因 以及大腸桿菌I型菌毛黏附素以基因轉化鴨疫里默氏菌臨床分離株，并以殼寡糖作為佐 劑制備新型鴨疫里默氏菌菌影疫苗及其應用的技術方案。本發明所提供的技術方案對有效 防治鴨疫里默氏菌感染，以及減少家禽養殖過程中抗菌藥物的使用、減少藥物殘留等具有 重要意義。
[0006] 為了解決【背景技術】所存在的問題，本發明是采用以下技術方案： 選擇本實驗室鑒定保存的2型鴨疫里默氏菌臨床分離株(編號為LY2)作為基礎菌株。 利用常規分子生物學技術，將本實驗室從鴨源大腸桿菌克隆得到的編碼fimA黏附素亞單 位的如以基因與噬菌體PhiX174的E基因（簡稱E)，通過編碼柔性連接臂（GLy 4Ser)^ Linker連接，獲得piJAE的串聯基因 piW-E，進一步將其與溫控表達載體pBV220連接，構 建溫控表達載體pBV-/?iW-E。將pBV-piW-E電轉化按常規試驗方法制備的鴨疫里默氏菌 感受態細胞，篩選陽性克隆得到鴨疫里默氏菌工程菌。
[0007] 將所述鴨疫里默氏菌工程菌，在溫度為20-30°C條件下增菌培養至OD6。。值為 0. 3-1. 0,然后迅速升溫至40-45°C誘導裂解基因；當0D_值不再降低時，降溫至30-38°C， 按5:1-10:1的比例加入7-12 μ g/mL的聚賴氨酸作用24-30h，以充分滅活殘存的活菌而不 破壞其表面結構。然后離心分離菌體，冷凍干燥。菌體抽樣，稀釋后涂平板檢測，確證不存 在活菌，即得到鴨疫里默氏菌菌影。
[0008] 將殼寡糖配水溶液，加入上述菌檢無活菌的鴨疫里默氏菌菌泥中，充分攪拌形成 均一混合物，使菌影含量達到5Χ101(] cfu/mL，分裝于西林瓶，冷凍干燥，即得到鴨疫里默氏 菌菌影殼寡糖佐劑疫苗。
[0009] 其中，殼聚糖配制成濃度為1. 5-4% (w/v)的水溶液，進一步優選為2% (w/v)。
[0010] 其中，進一步優選，步驟（3)中，在溫度為28°C條件下增菌培養至0D_值為0. 7,然 后迅速升溫至42°C誘導裂解基因；當0D_值不再降低時，降溫至37°C，按9:1的比例加入 10 μ g/mL的聚賴氨酸作用24h，以充分滅活殘存的活菌而不破壞其表面結構。
[0011] 疫苗使用前，加生理鹽水適當稀釋，飲水免疫雛鴨。在進行飲水免疫時，由于菌 影被帶正電荷的殼寡糖所包裹，可以較緊密地吸附于消化道黏膜表面，該疫苗的菌影通過 以表達的黏附素 fimA亞單位與消化道黏膜上皮細胞表面的相應受體特異性結合，從而 有機會被局部的免疫細胞所識別，進而發生抗原遞呈激發局部的黏膜免疫反應，此外，殼寡 糖作為載體還具有保護抗原免除降解和緩釋作用；另一方面，fimA亞單位也具有良好的免 疫原性，可以刺激機體產生抵御大腸桿菌黏附的免疫抗體。
[0012] 與現有技術相比，本發明涉及的以殼寡糖為佐劑負載黏附素的鴨疫里默氏菌菌影 疫苗具有如下優點和顯著進步： ①通過鴨疫里默氏菌菌影負載大腸桿菌黏附素亞單位，提高了無活動能力的菌影與 消化道黏膜的結合力，從而使消化道和呼吸道局部免疫成為可能。
[0013] ②本發明所提供的鴨疫里默氏菌菌影疫苗，可以通過飲水免疫，避免了注射免疫 的應激，應用方便，適應規模化養殖。
[0014] ③傳統滅活疫苗以及目前所報道的有關鴨疫里默氏菌菌影疫苗，通過注射免疫， 只能引起體液免疫反應，保護效果有一定局限性。本發明所提供的技術方案，可引起消化道 和呼吸道的黏膜免疫反應而提供抵抗細菌感染的第一道防線，殼寡糖可以促進菌影透過黏 膜進入體內，刺激機體的體液免疫，從而提供較全面的免疫保護。
[0015] ④本發明所提供的技術方案，既可以為鴨疫里默氏菌的感染提供保護，又可以通 過抑制大腸桿菌在消化道和呼吸道的黏附而減輕大腸桿菌的感染，適用于生產實踐中鴨傳 染性漿膜炎與大腸桿菌病混感的預防。
【具體實施方式】
[0016] 以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步描述，但是本發明的 保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明 的保護范圍之內。 實施例
[0017] -、負載黏附素的鴨疫里默氏菌菌影的制備 1溫控表達載體的構建將噬菌體PhiX174裂解蛋白E基因序列（GI :9626372)與從 鴨源致病性大腸桿菌克隆得到的編碼fimA黏附素亞單位的pi以基因通過15個柔性氨基 酸Linker (GLy4Ser) 3串聯為piW-E雙基因，轉入克隆載體PMD19T-simpLe中，構建重組克 隆載體pMD-/?i以-E。然后用及和/^I內切酶分別對溫控表達載體pBV220和重組克 隆載體pMD-/?iW-E進行雙酶切和連接，構建重組溫控表達載體pBV-/?iW-E。
[0018] 2電轉化及陽性克隆的篩選取1 μ L溶菌質粒加入100 μ L新鮮制備的RA2感 受態細胞中，小心混勾，冰上放置5min后移入0.1 cm的電擊杯中。電參設置為：15Kv/cm， 50 μ Fd，150 Ω，5ms，進行電擊轉化。電擊后，立即往電擊杯中加入960 μ L TSB培養基，將菌 液轉移至I. 5mL滅菌離心管中，28°C，150rpm搖菌2h。離心菌液，棄掉800 μ L上清，用剩余 液體重懸菌體，傾入到改良TS