一種無菌可注射材料的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種無菌可注射材料的制備方法，特別涉及無菌可注射透明質酸凝膠 的制備方法。
【背景技術】
[0002] 透明質酸（Hyaluronic acid)是一種是由單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺 組成的高分子粘多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之間由0-1，3-配糖鍵相連，雙糖 單位之間由0-1，4-配糖鍵相連。商品化透明質酸一般為其鈉鹽，即透明質酸鈉（Sodium Hyaluronate)，簡稱HA，習慣上仍稱為透明質酸。透明質酸以其獨特的分子結構和理化性 質在機體內顯示出多種重要的生理功能，尤其具有特殊的保水作用，是目前發現的自然界 中保濕性最好的物質，被稱為理想的天然保濕因子（Natural moisturizing factor，NMF)。 透明質酸廣泛分布于人體各部位，其中皮膚也含有大量的透明質酸。透明質酸被廣泛應用 于眼科粘彈性保護、骨關節功能改善、外科防粘連、組織填充等醫用和整形美容領域。透明 質酸被注入真皮或皮下組織中，使皮下組織容積增大，同時透明質酸可以吸收周圍組織的 水分，使原本松弛、凹陷的皮膚體積增大而恢復飽滿的形態。在整形美容領域，透明質酸主 要用于填充面部凹陷、除皺、隆鼻、治療半側顏面部萎縮等方面。
[0003] 由于人體透明質酸酶、自由基降解等原因，外援天然的透明質酸在體內維持存在 的時間短，限制了透明質酸在皮下組織填充或皮膚修復、手術防粘連以及關節腔潤滑等方 面的應用。因此，國內外一些公司研究通過改進不同的加工工藝來提高透明質酸在人體內 降解周期。
[0004] 透明質酸在體內的降解周期受到材料本身和體內微環境的影響，而本身主要受到 材料組成和加工工藝影響。最近一些年，國外一些公司使用交聯劑，例如1，4-丁二醇縮水 甘油醚（BDDE)，制造的交聯透明質酸被應用于軟組織填充，在體內降解周期只有達到6到 12個月的時間，整形美容患者需要連續注射兩次才可以達到預期效果。很顯然，這樣快的降 解周期滿足不了人們對于更長降解周期透明質酸產品的需求。
[0005] 大家知道，透明質酸注射前必須滅菌，透明質酸凝膠在110°C以上加熱處理或者輻 照處理后，穩定性不好，滅菌后的彈性模量G'顯著降低，降解加快，會影響其被植入體內后 填充效果。一些專利講到透明質酸與維生素C或其衍生物的應用，專利W0 2012/104419提 示可以通過添加一定量的維生素C及其衍生物到含有鎮靜劑的透明質酸，可以提高透明質 酸的熱穩定性，使得滅菌后彈性模量G'的變化不大。但是，該專利又指出單獨添加維生素 C及其衍生物對透明質酸材料的穩定性沒有作用或者作用不顯著。專利US2014/0088037 也顯示添加維生素C磷酸酯鎂（MAP)HA的彈性模量G'滅菌后保持不變或者提高5-400Pa。 但專利的產品存在大小不一的透明質酸顆粒，通過增大顆粒來維持降解周期的。透明質酸 顆粒較大時，雖然對穩定有幫助，但是大顆粒常常不柔軟，植入時非常困難，而且植入人體 后往往伴有脹痛和不舒適感的產生。瑞典公司Q-MED AB公司生產透明質酸產品一瑞藍 2 被臨床應用多年，將近150萬人次使用過，顯示安全、有效。但是，臨床也反 映，由于該產品含有大小不均一的凝膠顆粒，柔軟度不高，植入體后會有脹痛等不舒適感而 且體內降解周期太短，半年內往往需要二次注射。美國專利No. 2011/0171286提到，添加維 生素B、維生素C、微生素E中至少一個的交聯透明質酸凝膠表現出比不含添加物的交聯透 明質酸凝膠有更大的穩定性。該專利產品成凝膠狀態，雖然延展性好，但是可塑形較差，影 響了在整形方面應用。
[0006] 因此，本發明提供一種制備降解周期更長、可塑性強、穩定性好且柔軟度高的無菌 可注射材料的方法，來解決上述存在的問題。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種無菌可注射材料制備方法。
[0008] 透明質酸凝膠是指由交聯透明質酸凝膠和自由透明質酸組成的混合物。交聯透明 質酸凝膠是指用交聯劑交聯透明質酸形成的凝膠。自由透明質酸溶液是指透明質酸干粉溶 解于中性生理性等滲磷酸緩沖液或水中形成的溶液，不含交聯劑。中性生理性等滲磷酸緩 沖液是指由Na2HP04、NaH2P04和NaCl組成或Na2HP04、KH2P04和NaCl組成構成的pH值為 6. 5-7. 5、滲透壓為280-320m0sm〇l/L溶液。交聯度是指透明質酸雙糖單體結合一個交聯劑 分子的百分比，用透明質酸單體與交聯劑的摩爾比計算。
[0009] 將平均分子量在1. OMDa-4. OMDa的稱為高分子量透明質酸，將0. 2MDa-0. 99MDa的 稱為低分子量透明質酸。高分子量透明質酸對延長交聯透明質酸凝膠降解周期很重要，低 分子量對交聯透明質酸凝膠柔軟度很重要，選擇合適的比例，對于產品的長效性、柔軟度很 關鍵。
[0010] 一種制備無菌可注射材料的方法，步驟包括：
[0011] 第一步，提供交聯透明質酸凝膠：將高分子量透明質酸和低分子量透明質酸干粉 至少3:1(W/W)的比例溶解形成水溶液，堿性條件下漸進添加雙功能或多功能的交聯劑，添 加總濃度范圍是0. 005-0. 05mol/L。然后外力作用下使透明質酸分子垂直方向、水平方向 間歇交錯交聯，隔一段時間交錯進行一次。接著低溫自由平衡溶脹分離除去多余的自由交 聯劑殘，交聯透明質酸凝膠中自由交聯劑的殘留量小于lppm。交聯透明質酸凝膠的交聯度 是2. 5% -15%，也可以是3% -12%，或者5% -10%，當然，其他適宜的交聯度只要滿足要 求也是可以的。雙功能或多功能的交聯劑，比如可以是1，4-丁二醇縮水甘油醚、乙二醇而 縮水甘油釀、1 _乙基_3_ (3-二甲氨基-丙基）-碳二亞胺、二乙烯基諷、聚乙二醇、1，3-二 環氧丁烷、N-羥基琥珀酰亞胺、1，2, 7, 8-二環氧辛烷其中的一種或多種。
[0012] 第二步，將第一步形成的交聯透明質酸凝膠低溫均質，形成均一微粒。所謂的低溫 范圍是不高于8°C。可以是液氮溫度，也可以在-20-10°C或者-12-8°C，也可以是-4-6°C或 者0-4°C。低溫條件可以保證交聯透明質酸凝膠和透明質酸分子在均質過程沒有受到或者 受到的熱所引起不利影響非常小，同時也可以改變其形態。低溫后可以采用研磨均質、粉碎 均質、切割均質，或者其他適宜的低溫均質方式得到均一的交聯透明質酸凝膠微粒，當然， 均質的方式不局限以上幾種，其他適宜的均質方式只要滿足要求也是可以的。根據需要， 可以將交聯透明質酸凝膠均質成能通過27G-32G的注射針的均一顆粒，粒徑大小的范圍是 40-300 y m，也可以是60-200 y m或者80-120 y m。這樣的粒徑，可以保證注射時阻力小且柔 軟度高，又可以保證可塑性強，易于塑形，且能保證合適的降解周期。
[0013] 第三步是將高分子量透明質酸干粉溶解于中性生理性等滲磷酸緩沖液中形 成自由透明質酸溶液，然后添加水溶性維生素，比如水溶性維生素B、維生素C或維生 素E的衍生物中的一種或多種，添加濃度是0. 01-50mg/ml，也可以是0. l-30mg/ml或者 0.5-20mg/ml。維生素B的衍生物可以硫是辛酸。維生素C衍生物可以是維生素C糖苷 (Ascorbyl-2-glucoside)，比如選用AA2G?。維生素C衍生物可以是維生素C磷酸酯鹽，比 如維生素C磷酸酯鎂、維生素C磷酸酯鈉、維生素C磷酸酯鈣。水溶性維生素E衍生物可以 是TPGS，一種叫做天然水溶性維生素E。水溶性維生素的添加，不僅可以提高透明質酸對熱 或者輻照的穩定性，如彈性模量G'提高10-300Pa，而且還能起到美白、清除自由基等其他 功效，但是水溶性維生素濃度太高反而會產生其他不利結果。因此，本步驟必須衡量一個平 衡點，將預期想要的和預期避免的結果保留在一個可接受的范圍，而且這個范圍符合相關 安全要求。將制備的自由透明質酸溶液以1:49-3:7(W/W)比例添加至第二步獲得的產物 中，比例還可以是1:24-2:8 (W/W)，其他適宜的比例滿足要求也是可以的。接著，在不剪切透 明質酸分子鏈的機械力作用下混勻，可以使用設備混勻或者用手進行混勻。
[0014] 本步驟中，還可以添加右旋糖酐和/或利多卡因。右旋糖酐對植入部位的血液微 循環起到一定的幫助作用，對減少后遺癥會產生有利的幫助，右旋糖酐可以是高分子量右 旋糖酐、中分子量右旋糖酐、低分子量右旋糖酐、小分子量右旋糖酐中的一種或幾種，濃度 為1%-10% (W/W)之間。利多卡因的添加，可以在透明質酸產品植入后一段時間提高使用 者的舒適度，減少疼痛感等癥狀。本發明推薦的利多卡因添加濃度為0.1 %-3% (W/W)，也 可以是0.3%-1% (W/W)，或其他適宜的濃度范圍。
[0015] 第四步是將第三步形成的產物進行滅菌。滅菌方式可以是濕熱滅菌、環氧乙烷滅 菌、輻照滅菌其中一種或多種組合。濕熱滅菌可以是115-130°C、4-30min高壓滅菌。輻照 可以是x射線、0射線或y射線輻照滅菌。無論哪一種滅菌方式均不能影響可注射材料 的理化性能，例如降解周期、彈性模量G'、推擠力等性能。
[0016] 本發明提供的無菌可注射材料，濃度為15-35mg/ml，或者為18-30mg/ml，也可以 是20-27mg/ml或者22-25mg/ml，當然，其他適宜的濃度滿足要求也是可以的。
[0017] 本方法制備的無菌注射材料，體內降解周期至少在18個月以上，常常能保持 24-36個月，有的甚至36個月以上。無菌注射材料穩定性好，可以在高溫加熱、輻照或者環 氧乙烷處理后，彈性模量G'有良好的維持效果。此外，無菌注射材料有優良的可塑性與柔 軟度，制備工藝簡單、易于產業化。
[0018] 本發明提供的無菌注射材料，可應用于軟組織填充、修復以及外科手術醫療等。例 如，可以用于非醫療的提高皮膚的美觀度、填充或去除皺紋、隆鼻、隆胸，也可以用于醫療外 科手術用的防粘連和骨科關節的潤滑。 實施例
[0019] 實施例一：制備交聯透明質酸凝膠
[0020] 取3g高分子量透明質酸（1. OMDa)和lg低分子量透明質酸（0. 4MDa)干粉溶解于 50ml、pH 8. 5水溶液，分兩次添加1，4- 丁二醇縮水甘油醚進行交聯，1，4- 丁二醇縮水甘油 醚終濃度0.001M。交聯過程有兩次向下壓力、兩次左右水平的力各作用10分鐘。接著中性 生理性等滲磷酸緩沖液在4-8°C條件下溶脹至pH值為7. 2除去未交聯的交聯劑，交聯產物 的交聯度是2. 5%。在4-8°C均質化，形成均一的交聯透明質酸凝膠微粒，然后分成四等份。
[0021] 實施例二：制備無菌可注射透明質酸凝膠
[0022] 取0. 2g高分子量透明質酸（1. 6MDa)溶解于5ml中性生理性等滲磷酸緩沖液形 成自由透明質酸溶液，添加250mg維生素C磷酸酯鎂（MAP)。將制得溶液以1:49的比例添 加至實施例一產物的一份中，然后手動攪拌混勻。130°C、4min濕熱滅菌。實施例二制得的 透明質酸凝膠性能參數見表1，其中推擠力是通過一次性注射器帶30G的針頭、在推擠速度 10. 5mm/min條件下測定的。
[0023]表1.
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