一種牛羊腐蹄病油乳劑疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種牛羊腐蹄病疫苗及其制備方法，具體涉及一種牛羊腐蹄病油乳劑 疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 腐蹄病（Foot rot)是反芻動物的一種常見病，在我國除在東北和西北及西藏、內 蒙奶牛的腐蹄病發病率相對較低外，其余地區尤其在南方，奶牛、山羊、綿羊腐蹄病廣泛流 行，其發病率高達8%~20%，甚至30%~50%。由于不科學的飼養管理、不良的環境條 件、產后疾病、遺傳等因素造成奶牛和綿羊蹄裂、蹄漏、蹄底或蹄踵潰瘍等損傷，降低蹄部抵 抗力，最終引發病原菌感染，加重蹄部損傷。而且牛羊腐蹄病治愈率低、淘汰率高，治療時間 長、藥費高，治療期用藥導致廢棄牛奶而導致經濟損失嚴重。可見，牛羊腐蹄病是困擾奶牛、 羊養殖的嚴重問題。
[0003] 奶牛和羊腐蹄病的病原有多種，既有需氧菌又有厭氧菌及兼性菌，多數學者認 為牛和羊腐蹄病的主要病原是壞死梭桿菌（Fusobacterium necrophorum)和柿瘤擬 桿菌（Bacteroides nodosus)，腐蹄病的發生主要是二者共同感染而引起的。其中，壞 死梭桿菌是牛羊腐蹄病的最重要病原，可引起多種器官化膿病變（如牛肝膿腫、人的 Lemierre's綜合癥、腦炎等疾病）和其他偶蹄動物的蹄部感染。壞死梭桿菌屬于梭桿菌屬 (Fusobacterium Knorr 1922)是一種多形性細菌，培養特性嚴格厭氧，Feldman等報道，在 14株從牛的肝膿腫分離出的壞死梭桿菌中，有4種不同的抗原群。
[0004] 目前，國內外預防牛、羊腐蹄病的發生主要是定期采用硫酸銅、硫酸鋅、多聚甲醛 或福爾馬林等藥浴和定期修蹄，減少蹄部損傷等。治療采用硫酸銅或碘包扎，全身注射抗生 素，但由于其蹄部一直接觸地面，處于感染狀態，治療效果差。國外有商品滅活疫苗，但因為 腐蹄病病原復雜在不同地域使用效果差異大。油乳劑疫苗是國內外疫苗市場上產量最多 的滅活疫苗，其免疫性能穩定、生物安全性高、較小的免疫劑量和較少的免疫次數就能達到 延長免疫刺激時間，使機體獲得足夠的保護性抗體。而傳統油乳劑疫苗在生產過程中將司 班-80加入白油中作為油相，吐溫-80、硬脂酸鋁加入抗原水溶液中作為水相，二者混合乳 化獲得的油乳劑疫苗穩定性高，免疫后可獲得持久的較高水平的免疫抗體；但是該油乳劑 疫苗粘度大，免疫注射引起的應激反應較大，可形成無菌性化膿灶，在接種部位出現腫脹、 硬結，或形成肉芽腫，免疫效果差；同時對動物肉制品質量也產生了不良的影響。由此可見， 硬脂酸鋁含量、油相、水相，油相水相比例、剪切時間、自油的品質是影響油乳劑疫苗黏度的 重要因素，油乳劑疫苗存在著菌株大量培養困難、免疫效果以及引起的不良副反應等缺點。 因此，探索一種具有低粘度、良好穩定性、免疫效果好、副作用小的牛羊腐蹄病油乳劑疫苗， 必將對牛、羊養殖業和我國畜牧業的健康發展具有重要的意義。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是，提供一種具有低粘度、良好穩定性、免疫效果好、 臨床不良反應小、成本低的牛羊腐蹄病油乳劑疫苗及其制備方法。
[0006] 本發明解決其技術問題采用的技術方案是，一種牛羊腐蹄病油乳劑疫苗，由油相 與水相按重量份比為1.5-3 : 1(優選2 : 1)，終濃度為0.005%~0.01% (優選1%)硫 柳汞溶液構成，其中，所述油相由高壓滅菌的藥用白油、10 %的Span-80白油混合液、10 % 的甘露醇單油酸酯白油混合液按照1.8~2.2 : 1 : 1(優選2 : 1 : 1)的比例構成；所 述水相將4%~7% (優選5. 7%)的蔗糖酯溶于含10%吐溫80和10%聚氧乙烯蓖麻油 衍生物水溶液，然后與抗原溶液按照1:2. 5~3 (優選1:2. 8)的比例構成；所述抗原溶液是 將壞死梭桿菌經過壞死梭桿菌傳代培養培養基傳代，壞死梭桿菌擴大培養培養基放大培養 后，進行濃縮，滅活得到每毫升菌液菌數不低于4X K^CFU的菌液。
[0007] 進一步，所述壞死梭桿菌傳代培養培養基為牛腦心浸液培養基；所述壞死梭桿菌 擴大培養培養基為改良心腦浸液培養基。
[0008] 本發明進一步解決其技術問題采用的技術方案是，一種牛羊腐蹄病油乳劑疫苗的 制備方法，包括以下步驟：
[0009] (1)生產用種子的制備：采用壞死梭桿菌傳代培養培養基先將壞死梭桿菌進行一 級種子繁殖，鑒定合格后，再進行二級種子繁殖得到二級種子；
[0010] (2)抗原溶液的制備：在發酵罐內的壞死梭桿菌擴大培養培養基中按培養基總量 的5~10 %接種二級種子培養，收獲菌液，取樣進行純粹檢驗，應純粹，同時作活菌計數，活 菌數應不低于4 X 109CFU ;然后菌液濃縮，使每毫升菌液菌數不低于4 X K^CFU ;再滅活；
[0011] ⑶油相的制備：將高壓滅菌的藥用白油、10%的Span-80白油混合液、10%的甘 露醇單油酸酯白油混合液按照1. 8~2. 2 : 1 : 1的比例混合，35~38°C水浴片刻，充分 搖勻，即得油相；
[0012] (4)水相的制備：將4%~7%的蔗糖酯溶于含10%吐溫80和10%聚氧乙烯蓖麻 油衍生物水溶液，然后與抗原溶液按照1:2. 5~3的比例混勻，即得水相；其中，聚氧乙烯 蓖麻油衍生物是由不同量環氧乙烷和蓖麻油或氫化蓖麻油反應得到的一系列物質，兩種主 要衍生物為聚氧乙烯35蓖麻油（EL-35)和聚氧乙烯40氫化蓖麻油（RH-40)，其HLB值為 13~15,主要應用于水不溶性藥物或其他脂溶性藥物的增溶劑和乳化劑，可防止溶血，并 能很快通過尿液排泄，中國藥典未收載，收錄于歐洲藥典和美國藥典。TW-80作為增溶劑、乳 化劑和穩定劑已收入多國藥典，隨著近年來藥理學研究的深入，人們認識到吐溫80是具 有一定生物和藥理活性的物質，并與藥物臨床上出現的不良反應相關，并且濃度為4%時 有輕微的溶血作用。
[0013] (5)乳化：將油相與水相按重量份比為1. 5~3 : 1進行剪切10~15min后，在 終止前加入2 %硫柳汞溶液，使其最終濃度為0. 005 %~0. 01%。
[0014] 進一步，所述牛羊腐蹄病油乳劑疫苗的制備方法，包括以下步驟：
[0015] (1)種子的制備：將壞死梭桿菌接種于牛腦心浸液培養基中，在37~39°C厭氧培 養48小時，取樣接種心腦浸液瓊脂平板，37~39°C厭氧培養48~96小時，純粹檢驗合格 后，作為一級種子；取一級種子接種于pH7. 6心腦浸液培養基，37~39°C厭氧培養36~48 小時，取樣做純粹檢驗，合格后作為二級種子；
[0016] (2)疫苗抗原溶液的制備：將發酵罐內的改良心腦浸液培養基預熱至37~39°C， 按培養基總量的5~10%接種二級種子，37~39°C培養10小時；收獲菌液，取樣進行純 粹檢驗，應純粹，同時作活菌計數，活菌數應不低于4X 109CFU ;用0. 22 y m的中空纖維超濾 器將純檢合格的菌液濃縮，使每毫升菌液菌數不低于4X K^CFU ;調節培養液pH至6. 8~ 7. 2,按菌液總量的0. 3%加入甲醛溶液，置37°C滅活24小時，期間每隔6~8小時攪拌1 次；
[0017] (3)油相的制備：將高壓滅菌的藥用白油、10%的Span-80白油混合液、10%的甘 露醇單油酸酯白油混合液按照2 : 1 : 1的比例混合，37°C水浴片刻，充分搖勻，即得油 相；
[0018] (4)水相的制備：將5. 7%的蔗糖酯溶于含10%吐溫80和10%聚氧乙烯40氫化 蓖麻油水溶液，然后與疫苗抗原溶液按照1:2. 8的比例混勻，即得水相；
[0019] (5)乳化：取油相2份放于膠體磨內，慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相1份，加完 后再以8000r/min攪拌10~15分鐘，在終止攪拌前加入2%硫柳汞溶液，使其最終濃度為 0? 01%〇
[0020] 本發明通過培養基優化，篩選出壞死梭桿菌擴大培養的條件，降低了壞死梭桿菌 的培養成本；在疫苗乳化油相配方上，選用優質高效乳化劑蔗糖