隨機份成4組，每組15只。在豚鼠背部脊柱兩側將脫毛劑均勻涂上，使其 脫毛范圍約40平方厘米。洗凈脫毛劑，觀察24小時后每組豚鼠分別涂本發明外用噴霧劑 0. 2、0. 4和0. 8ml，分別含生藥92、184和368mg)，另一組涂溶媒0. 8ml每日二次，連續30 天，觀察豚鼠的一般情況，實驗結束后處死動物進行血液學、血液生化及病理學檢查。
[0074] 2、結果
[0075] 上述三組用藥豚鼠軀干去毛區，未見局部皮膚有水腫、充血、紅斑、出血點及潰瘍。 用藥組與對照組動物毛發色澤、攝食、四肢活動等對照組無明顯差異，血液生化檢查，用藥 組與對照組均在正常范圍。病理組織學檢查，實驗各組心、肝、腎及局部皮膚均未見明顯病 變。提示，本發明中藥制劑長期用藥對局部皮膚及全身重要臟器均未見明顯的毒性作用。試 驗結果表明：本發明中藥制劑實驗安全。
[0076] 本發明外用制劑抗菌試驗
[0077] 實驗材料
[0078] 1、受試動物：昆明種小鼠，18_22g，雌雄各半；9日齡雞胚。2、細菌和病毒：細菌菌 株均為臨床分離株，共97株；流感病毒鼠肺適應株FM1株。3、培養基板:MH培養基；肺炎鏈 球菌采用血培養基，即在MH培養基中加入5%脫纖維羊血制成；流感嗜血桿菌采用巧克力 培養基。
[0079] 2、體外抗菌試驗
[0080] 1、體外最低抑菌濃度（MIC)的測定
[0081] (1)實驗方法：受試藥（本發明外用制劑）提取浸膏用滅菌生理鹽水稀釋至下列 濃度梯度，s卩 1600、800、400、200、100、50、25、12. 5、6. 25、3. 13(mg/ml)，分別吸取 1. 5ml至 無菌平皿中，再加入13. 5ml恒溫55°C水浴中的滅菌MH培養基，混勻后冷卻備用。各藥物平 板中藥物的最終濃度為 160、80、40、20、10、5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 313(mg/ml)。同時設空白 對照組。將培養8-12h的試驗菌用滅菌生理鹽水稀釋至所需濃度（一般為107CFU/ml)，采 用多點接種儀接至不同濃度的藥物平板，接種量約為104~105CFU。試驗菌于37°C恒溫培 養24小時觀察結果，并記錄MIC值。
[0082] (2)實驗結果
[0083] 體外抗菌試驗結果表明（下表），藥物對上呼吸道感染的革蘭陽性和革蘭陰性臨 床致病菌均具有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、嗜血流感 桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的MIC50分別為10、20、20、2. 5、40、20和10mg/ ml，MIC90 分別為 80、40、80、20、160、40 和 160mg/ml。
[0084] 表1體外抗菌作用
[0085]
[0086] 藥理學實驗說明：
[0087] 1材料
[0088] 1. 1動物：健康3月齡純系昆明種雌性小鼠60只，體重25~35g，山東大學實驗動 物學部提供。動物飼養條件：每組小鼠按組別分籠飼養。在自然條件相同的情況下，常規飼 食飲水，保持自然光照，無不良因素影響，飼養1周適應實驗環境后開始進行實驗，
[0089] 1. 2實驗藥品：本發明面膜，按實施例3方法制備，濃度：0.12mg/ml，本院藥劑科生 產。3%氫醌霜：武漢市中醫醫院藥劑科生產，批號20050905。黃體酮注射液：浙江仙琚制 藥股份有限公司，批號=20050115。
[0090] 1. 3試劑：硫化鈉（NaS):海凌峰化學試劑有限公可，批號：20020118,臨用前配成 10%水溶液。超氧化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)試劑盒：南京建成生物工程研究所，批 號：20059116。
[0091] 1. 4主要儀器：DY89-II型電動玻璃勻漿機：寧波新蘭生物科技股份有限公司。系 統生物顯微鏡：〇LYMPUS;BX50F4北航病理圖像分析系統。
[0092] 2實驗方法
[0093] 2. 1模型制作：參照黃褐斑實驗動物模型復制方法。小鼠2. 5%戊巴比妥鈉麻醉 后，以0. 4%的黃體酮注射液按0. 02g/kg劑量小鼠后肢肌肉注射，每周6次，連續4周。正 常組按0. 02g/kg肌肉注射滅菌注射用水。
[0094] 2. 2動物分組及給藥：取健康雌性小鼠60只，3個劑量組，隨機分為6組，每組10 只。正常組、模型組、本發明膠囊劑3個劑量組（0. 15、0. 3、0. 6mg/ml)、3%氫醌陽性對照組 (0. 6mg/ml)。本發明3個劑量治療組分別在小鼠造模當日用藥，每日2次，每周6次，連續 用藥30天。正常組和模型組于相應時間給予蒸餾水；3%氫醌陽性藥對照組于造模當日開 始局部用藥，時間和療程同祛斑養顏口服液治療組。
[0095] 2. 3觀察指標及檢測：用藥30天后，頸椎脫臼處死小鼠，背部去毛，迅速取肝組織 及涂藥部位的皮膚組織各2塊，其中一塊用冰冷的生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，切 取肝臟及皮膚各0. 5g，分別放入2. 0ml預冷生理鹽水的燒杯中，剪碎組織，再倒入試管中， 以高速分散器l〇r/min勻漿兩次，每次10秒；再以3500r/min轉速離心15分鐘，取上清液。 采用黃嘌呤氧化酶法，按試劑盒檢測說明書方法測定SOD;采用硫代巴比妥酸法，按試劑盒 檢測說明書方法測定MDA值。同時，分離小鼠背部皮膚，取去毛的皮膚組織一塊（2cm*lcm 左右），10%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，HE染色，常規組織病理檢測，光鏡觀察，計 數上皮增生、真皮血管數及真皮炎細胞數；免疫組化染色，觀察黑色素細胞染色和數目（陽 性細胞：無，計〇分；< 15%，計0. 5分，< 30%，計1分；> 30%計2分）。
[0096] 2. 4統計學方法：計量資料采用組間比較t檢驗；分層計算資料采用秩和檢驗進行 統計處理。
[0097] 3 結果
[0098] 3. 1各組小鼠皮膚、肝組織MDA、S0D含量的測定見表1。
[0099] 表1各組小鼠皮膚及肝組織MDA、S0D含量的測定（-x土s)
[0100]
[0101]
[0102] 與模型組比較*P< 0. 05,#P< 0. 01 ;與陽性組比較##P< 0. 05
[0103] 3. 2各組小鼠皮膚病理組織形態學及免疫組織化學觀察病理形態學觀察可見：正 常組小鼠表皮的上皮層細胞排列整齊，無增生，真皮層內未見小血管擴張，炎性細胞少見。 模型組小鼠表皮的上皮層細胞增生明顯，核大且排列紊亂，真皮層內可見小血管擴張，炎性 細胞多見。大、中劑量組及陽性對照組小鼠表皮的上皮層細胞增生有所減輕，排列紊亂減 輕，真皮層內小血管擴張減輕，炎性細胞少見。結果見表2。
[0104] 免疫組織化學的病理形態學觀察可見：正常組小鼠上皮層內可見少許黑色素細 胞，胞漿著色棕褐色。模型組小鼠上皮層內可見大量黑色素細胞，胞漿著色深褐色，且陽性 細胞數> 30%。大、中劑量組及陽性對照組小鼠上皮層內可見黑色素細胞，胞漿著色深褐 色，陽性細胞數減少，見表2。
[0105] 表2各組小鼠皮膚組織病理形態學及黑色素細胞觀察結果（n)
[0106]
[0107]
[0108] 秩和檢驗；與模型組比較*P< 0. 05,#P< 0. 01
[0109] 4、外用藥劑的微循環實驗方法：
[0110] 4. 1材料與方法：取50只小鼠，隨機分成5組，每組10只（雌雄各半），對照組每鼠 右耳涂生理鹽水少許；陽性對照組每鼠右耳給予市售絲白祛斑軟膏（金陵藥業生產），受試 組分為本發明面膜劑量組400mg/kg/h、本發明面膜600mg/kg/h，本發明面膜高劑量800mg/ kg/h。15min后腹腔注射0. 1 %戊巴比妥鈉0.lml/10g麻醉動物，隨后尾靜脈注射0. 1 %腎 上腺素0.lmL/10g，立即觀察小鼠右耳微動靜脈口徑（ym)及0. 2mm2毛細血管網點數.t檢 驗處理實驗數據.
[0111] 4. 2結果與討論
[0112] 4. 2. 1.對微循環的影響
[0113] 與對照組相比，受試組1對小鼠毛細血管開放數有明顯增多（P<0.01);受試組2 對微靜脈口徑和毛細血管開放數有顯著增加（P< 〇.〇1);受試組3對小鼠微動、靜脈口徑 及毛細血管開放數皆有增加（P< 0.01);說明受試藥能改善微循環，有活血化瘀作用（表 1)〇
[0114] 表3、本發明外用膏劑對小鼠微動、靜脈口徑及毛細血管開放數的影響
[0115]
[0116] 4 討論
[0117] 黃褐斑中醫稱為"肝斑"，屬祖國醫學"黎黑斑"或"面塵"范疇。一般認為本病發 生與肝、脾、腎三臟關系密切。
[0118] 黃褐斑、肝斑是一種常見于面部的色素代謝障礙性皮膚疾病，好發于中年女性，其 病因及發病機理尚未完全闡明。一般認為黃褐斑的發病與內分泌失調，紫外線照射，遺傳因 素有關。但近年的研究認為，黃褐斑、肝斑的發生還與氧自由基變化有關。在正常生理情況 下，自由基不斷產生，但也不斷被消除，使之處于一種動態平衡。而黃褐斑、肝斑患者過氧化 脂質（LPO)或自由基水平增高時，或是體內抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、谷胱甘肽（CSH)等下降，不能及時清除過氧化脂質等氧化產物，使LP0在體內堆積。 從而加速酪氨酸系列氧化反應。致黑色素細胞產生黑色素增多；同時LP0極不穩定其產物 丙二醛（MDA)可導致蛋白質分子發生交聯，形成熒光發色團-色素。
[0119] 由此提示本發明可清除氧自由基并減少自由基產生；病理組織學觀察顯示其能 明顯改善組織細胞的病理改變，減輕上皮細胞增生，減輕真皮層小血管擴張，減少炎細胞數 目；免疫組化檢測顯示其可明顯減少上皮層內黑色素陽性細胞數及光密度。表明本發明具 有祛斑美白作用。
[0120] 中藥面膜外用，除直接改善面部血液循環，用白芷、白僵蠶等中藥活血化瘀，清熱 解毒。給予中藥面膜直接作用于皮膚，使之吸收而達到外治的目的。現代醫學研究顯示：酪 氨酸酶是黑素產生過程中重要的催化劑，抑制其活性則可以控制黑素的產生，白芨可抑制 酪氨酸酶的作用及其