一種制備具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提取物的制備方法，更具體的，涉及一種山楂葉提取物的制備方法。
【背景技術】
[0002]糖尿病(Diabetes melIitus1DM)是一種人體血液中胰島素含量不足而引發的內分泌代謝性紊亂的疾病。隨著生活水平的提高，國內外糖尿病患者日益增多，據WHO的統計，到2030年，糖尿病患者將會有3.66億之多，因此降低餐后血糖是預防糖尿病，減少其并發癥的重要措施。
[0003]α-葡萄糖苷酶抑制劑(a-Glucosidase Inhibitor)通過競爭性抑制抑制小腸上的α -葡萄糖苷酶的活性，降低碳水化合物的分解速度，延緩人體對葡萄糖的吸收，從而有效的降低用餐后血糖濃度的峰值。由于α-葡萄糖苷酶抑制劑具有安全、高效的優勢，已被醫學界列為第3類口服降糖藥物。目前臨床應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)和米格列醇(miglitol)，這三種物質結構類似葡萄糖，除此之外，通過文獻研究，萜類、黃酮類、生物堿類、酚類等化合物均具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性。從藥用植物中分離純化出的活性成分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用大都比市場上的降糖藥物強，如阿卡波糖、野尻毒素等。然而由于分離純化技術的限制，這些成分還不能大規模生產，該類產品產量低、價格高，因此需要研究創新技術運用到工業化中生產質優價廉的降糖產品。
[0004]山楂葉為山楂屬植物(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥葉，具有活血化瘀、理氣通脈的功效。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強，人們逐步認識到山楂葉良好的藥理功效，越來越關注山楂葉產品的開發利用，目前市場上的山楂葉保健產品包括復合袋泡茶、山楂葉綠茶等。現代藥理研究發現山楂葉提取物可以明顯降低小鼠血糖水平，改善脂質異常，具有明顯的降糖作用；Wang等研究發現山楂葉總黃酮可以調節血糖和脂質代謝，能夠顯著抑制小鼠對碳水化合物和甘油三酯的吸收，具有較好的降糖效果。
[0005]目前市售的具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的降糖藥物主要為化學合成藥物，如阿卡波糖，0-4，6-雙脫氧-4[[(1S, 4R, 5S, 6S)4, 5，6-三羥基_3_(羥基甲基)_2_環己烯]氨基]-(-D-吡喃葡糖基(I — 4)-O-)-D-吡喃葡糖基(I — 4)-D-吡喃葡萄糖，非天然，只用作藥物使用，無法作為保健食品等使用。
[0006]而天然植物產品多為直接作為茶葉等沖泡飲品等，無針對功效成分的提取，酶活抑制低。
[0007]本發明以天然山楂葉為原料，通過超聲輔助醇提-萃取-層析等技術進行分離純化獲得一種具有高α-葡萄糖苷酶抑制作用的山楂葉提取物制備方法。該提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用為阿卡波糖2.15?4.30倍(阿卡波糖是一種新型口服降糖藥。在腸道內競爭性抑制小腸的α葡萄糖苷酶。降低多糖及蔗糖分解成葡萄糖，使糖的吸收相應減緩，因此可具有使飯后血糖降低的作用。一般單用，或與其它口服降血糖藥，或胰島素合用。配合餐飲，治療胰島素依賴型或非依賴型糖尿病)。該發明為以山楂葉資源作為降糖保健食品或藥品開發奠定基礎。
[0008]因此，采用山楂葉這種天然資源為原料制備具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物，具有綠色、安全的特點；在食品和藥品等領域中都具有廣泛的應用前景。
【發明內容】
[0009]本發明的一個目的，在于提供一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的山楂葉提取物的制備方法。
[0010]本發明的一個目的，在于提供一種具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物。
[0011]本發明提供一種具有高α -葡萄糖苷酶抑制作用的山楂葉提取物制備方法，其包括如下步驟:
[0012]步驟1、將山楂葉干燥粉碎，制備得到山楂葉粉；
[0013]步驟2、采用超聲輔助法制備山楂葉提取液；
[0014]步驟3、將山楂葉提取液進行減壓濃縮以去除乙醇獲得濃縮提取液；
[0015]步驟4、向濃縮提取液添加水，震蕩使懸浮物充分溶解，將該溶液減壓抽濾得到水不溶物；
[0016]步驟5、將水不溶物經聚丙烯胺層析，以甲醇溶液為洗脫液，獲得流出液經減壓濃縮干燥為目標提取物。
[0017]優選的，步驟I中山楂葉干燥粉碎80-120目。
[0018]優選的，步驟2中，按山楂葉粉:乙醇=1:20?40 (w/v)的比例提取粗液，單次提取時間40?50分鐘，超聲功率400?600瓦，乙醇濃度60?85% ;將所提取粗液經超濾獲得濾液；優選的，反復提取并超濾2-3次后，將反復提取并超濾所得到的所述濾液合并為山楂葉提取液。
[0019]優選的，步驟3中采用減壓蒸餾法進行減壓濃縮，濃縮溫度為60度。
[0020]優選的，步驟4中按提取液:水=1:15 (v/v)向濃縮提取液添加水。
[0021]優選的，步驟5中甲醇溶液的濃度為65?85%。
[0022]本發明還提供一種具有α -葡萄糖苷酶抑制作用的山楂葉提取物，其由上述方法制得。
[0023]優選的，對α葡萄糖苷酶的IC5。值分別為0.64?1.28毫克/毫升(mg/mL)，該提取物對α -葡萄糖苷酶抑制效果為阿卡波糖的2.15?4.30倍。
[0024]本發明還提供一種對α -葡萄糖苷酶抑制率的測定方法，其包括步驟:
[0025]取25微升不同濃度樣品溶液于96孔酶標板中，加入50微升α -葡萄糖苷酶溶液(0.2酶活性單位/毫升)，混勻，37度恒溫條件下放置10分鐘后，加入5毫摩爾/升的PNPG50微升，混勾后于37度丨旦溫條件下放置20分鐘，最后加入150微升I摩爾/升的Na2CO3溶液終止反應，于405納米波長處測定吸光度。
[0026]優選的，所采用的酶活抑制率計算公式如下:
[0027]酶活抑制率=[Α空白_ (Α樣品-A背景)]/A空白X 100 %
[0028]其中，Aae:不加待測樣品反應后的吸光值；
[0029]A樣品:加入待測樣品反應后的吸光值；
[0030]A背景:只加待測樣品的吸光值。
[0031]本發明技術方案帶來如下的有益效果:
[0032]1、分離提取制備方法較為簡單可行，具有工業化制備的潛力；
[0033]2、酶活抑制率高于現有市售阿卡波糖；
[0034]3、原料為山楂落果后的山楂葉，來源廣泛，廉價易得，屬副產物綜合利用。
【具體實施方式】
[0035]為更進一步闡述本發明所采取的技術手段及其效果，以下通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案，但本發明并非局限在實施例范圍內。
[0036]下述實施例中的制備方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑廠商購買得到。
[0037]實施例1
[0038]具有山楂葉高α -葡萄糖苷酶抑制作用的山楂葉提取物制備方法如下:
[0039]步驟1、山楂葉干燥粉碎100目，制備山楂葉粉
[0040]步驟2、采用超聲輔助法，按山楂葉粉:乙醇=1:35 (w/v，質量體積比，本實施例例如單位選取克:毫升，山楂葉粉:乙醇=I: 35 (w/v)為I克山楂葉粉:35毫升乙醇)比例提取粗液，單次提取時間40分鐘，超聲功率480瓦，乙醇濃度70% ;再將所提取粗液經超濾獲得濾液；反復共提取并超濾3次(再將濾渣按照上述過程再重復提取2次)，將3次反復提取并超濾所得的所述濾液合并為山楂葉提取液。
[0041]步驟3、將山楂葉提取液進行減壓濃縮(減壓蒸餾法，使用真空旋轉蒸發儀以抽真空的方式來降