抗結腸癌黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物化學及生物醫藥技術領域，尤其涉及抗結腸癌黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉的制備方法。
【背景技術】
[0002]黃綠蜜環菌(AraziWaria Jyieo-Kireft?)，又名黃蘑燕、黃環菌，屬擔子菌亞門，層菌綱，口蘑目，口蘑科，蜜環菌屬。野生黃綠蜜環菌子實體中富含蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質、揮發油及多糖等營養成分。
[0003]目前，中國專利(CN103190279A)報道采用馬鈴薯、黃豆芽及復合VB培養基培養應用于飲料、口服液、調味品、膳食食品及保健藥膳方面的黃綠蜜環菌菌絲體，然而從黃綠蜜環菌次生代謝產物中規模化制備抗結腸癌浸膏粉的研究未見文獻報道。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種工藝簡單、易規模化實施、質量穩定可控的抗結腸癌黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉的制備方法。
[0005]為解決上述問題，本發明所述的抗結腸癌黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉的制備方法，包括以下步驟:
⑴菌體發酵:將黃綠蜜環菌菌種用PDA培養基進行液體發酵2~4個周期，每個周期7-20天，合并培養液，該培養液經離心后，得到上清液；所述上清液經減壓干燥即得黃綠蜜環菌次生代謝產物；
⑵液液分配富集:所述黃綠蜜環菌次生代謝產物用其質量10~20倍的分析純水分散，得到分散液；該分散液用10~20倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；所述乙酸乙酯萃取液經減壓干燥得黃綠蜜環菌次生代謝產物乙酸乙酯萃取部位；
⑶大孔樹脂柱色譜除雜:在所述黃綠蜜環菌次生代謝產物乙酸乙酯萃取部位中加入其質量5~10倍的水進行溶解，然后經大孔樹脂柱分離，并依次分別以水、體積分數為75%的乙醇溶液按5~10倍的柱體積進行梯度洗脫，收集75%乙醇洗脫物；該75%乙醇洗脫物經減壓干燥即得黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粗粉；
⑷硅膠柱層析分離:在所述黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粗粉中加入其質量3~5倍體積分數為90~100%的甲醇溶液進行溶解，經硅膠柱色譜分離后，用5~10倍柱體積的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按每份100~300 mL收集餾分，并經薄層色譜檢測，其中展開劑為氯仿、甲醇按5:5的體積比混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并Rf值為0.1-0.8的餾分；所述Rf值為0.1-0.8的餾分經減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉。
[0006]所述步驟⑴中黃綠蜜環菌菌種來源于中國科學院微生物研究所。
[0007]所述步驟⑴中離心速度為3000~8000 rpm。
[0008]所述減壓干燥條件是指真空度為0.07-0.09 MPa,溫度為60~70 °C。
[0009]所述步驟⑶中大孔樹脂柱為AB-8型樹脂柱或X-5型樹脂柱。
[0010]所述步驟⑷中氯仿-甲醇混合溶劑是指氯仿和甲醇按8:2~2:8的體積比混合而成的溶劑。
[0011]如上所述的抗結腸癌黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉的制備方法制得的黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉在制備抗結腸癌藥物或保健食品中的應用，其特征在于:該黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉作為有效組分按常規方法與藥學上可接受的任何載體制成各類抗結腸癌藥用制劑，或作為有效組分按常規方法與食品科學上可接受的任何載體制成各類保健類食品。
[0012]本發明與現有技術相比具有以下優點:
1、本發明采用黃綠蜜環菌菌種發酵生產黃綠蜜環菌次生代謝產物，發酵量可以按需求放大，不存在原料不足的問題。
[0013]2、本發明采用液液分配法富集黃綠蜜環菌次生代謝產物中乙酸乙酯萃取部位，溶劑價格低廉，而且可以再生循環使用，易于規模化。
[0014]3、本發明大孔樹脂柱可以再生循環使用，同時樹脂有脫色的功效，且回收率較高。
[0015]4、本發明采用硅膠柱層析分離，可直接將黃綠蜜環菌次生代謝產物中揮發性類組分與目標組分分開，同時去除部分強極性雜質。
[0016]5、本發明工藝簡單、重復性較好、質量穩定可控。
[0017]6、本發明所獲得的黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉經測試，具有很好的抗結腸癌的作用。
[0018]⑴實驗方法采用國際通用的MTT測定方法進行:首先，在96孔細胞板上接種2X 14個對數生長期的結腸癌細胞HCT116，3個復孔，細胞貼壁后；再加入不同濃度待測樣品，共設置7個藥物濃度梯度，分別為:1.0 yg/mL、5.0 yg/mL、10.0 yg/mL、20 yg/mL、30 μ g/mL、40 μ g/mL和50 μ g/mL的該黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉樣品組；72小時后，于96孔板對應孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μ L，繼續培養3 h ;棄去96孔板中上清液，加入100 yL DMSO溶解，使用酶標儀檢測570 nm波長下的吸光值并計算待測樣品對結腸癌細胞生長的半數抑制濃度IC5。。
[0019]⑵實驗結果表明，實施例1~3組黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉對結腸癌細胞株均有明顯的抑制作用，依次為30.6 μ g/mL,29.4 μ g/mL,30.1 μ g/mL，平均值為30.0μ g/mL。
【具體實施方式】
[0020]實施例1 抗結腸癌黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉的制備方法，包括以下步驟:
⑴菌體發酵:將黃綠蜜環菌菌種用PDA培養基進行液體發酵2個周期，每個周期20天，合并培養液，該培養液經3000 rpm的離心速度離心后，得到上清液；上清液在真空度為0.07 MPa、溫度為70 °C的條件下經減壓干燥即得黃綠蜜環菌次生代謝產物248.2 g。
[0021]其中:黃綠蜜環菌菌種來源于中國科學院微生物研究所。
[0022]⑵液液分配富集:黃綠蜜環菌次生代謝產物用其質量10倍的分析純水分散，得到分散液；該分散液用10倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液在真空度為0.07 MPa、溫度為70 °C的條件下經減壓干燥得黃綠蜜環菌次生代謝產物乙酸乙酯萃取部位81.4 go
[0023]⑶大孔樹脂柱色譜除雜:在黃綠蜜環菌次生代謝產物乙酸乙酯萃取部位中加入其質量5倍的水進行溶解，然后經大孔樹脂柱分離，并依次分別以水、體積分數為75%的乙醇溶液按5倍的柱體積進行梯度洗脫，收集75%乙醇洗脫物；該75%乙醇洗脫物在真空度為0.07 MPa、溫度為70 °C的條件下經減壓干燥即得黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粗粉56.1
g°
[0024]其中:大孔樹脂柱為AB-8型樹脂柱。黃綠蜜環菌次生代謝產物乙酸乙酯萃取部位與大孔樹脂比例為I g:50 mLo
[0025]⑷硅膠柱層析分離:在黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粗粉中加入其質量3倍體積分數為100%的甲醇溶液進行溶解，經硅膠柱色譜分離后，用5倍柱體積的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按每份100 mL收集餾分，并經薄層色譜檢測，其中展開劑為氯仿、甲醇按5:5的體積比(mL/ mL)混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并Rf值為0.1-0.8的餾分；Rf值為0.1-0.8的餾分在真空度為0.07 MPa、溫度為70 V的條件下經減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉44.0 go
[0026]其中:氯仿-甲醇混合溶劑是指氯仿和甲醇按8:2的體積比(mL/ mL)混合而成的溶劑。
[0027]娃膠柱的尺寸為30 mmX60 mm。
[0028]實施例2 抗結腸癌黃綠蜜環菌次生代謝產物浸膏粉的制備方法，包括以下步驟:
⑴菌體發酵:將黃綠蜜環菌菌種用PDA培養基進行液體發酵4個周期，每個周期7天，合并培養液，該培養液經8000 rpm的離心速度離心后，得到上清液；上清液在真空度為0.09 MPa、溫度為60 °C的條件下經減壓干燥即得黃綠蜜環菌次生代謝產物868.5 g。
[0029]其中:黃綠蜜環菌菌種來源于中國科學院微生物研究所。
[0030]⑵液液分配富集:黃綠蜜環菌次生代謝產物用其質量2