白細胞的細胞外誘捕網形成的抑制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種以乳鐵蛋白作為有效成分的白細胞的細胞外誘捕網形成抑制劑 和用于治療白細胞的細胞外誘捕網形成相關的疾病的組合物。另外，本發明涉及一種使用 所述抑制劑或組合物治療血細胞的細胞外誘捕網形成相關的疾病的方法。
【背景技術】
[0002] NETs(中性粒細胞細胞外誘捕網：neutrophil extracellular traps)為如下細胞 外結構物：由于細菌感染而活化中性粒細胞，分葉核的形態或染色質的分布變得不清楚，接 著核膜消失，染色質結構中混有細胞質或顆粒成分，在細胞膜破裂時放出網狀的結構物，捕 獲細菌或真菌、寄生蟲、病毒，發揮抗菌作用。NETs以DNA為中心，組蛋白3 (H3)或彈性蛋白 酶對其作用發揮重要的作用。NETs形成使有效殺死微生物的抗菌分子集中于局部。由于 產生NETs而中性粒細胞迎來細胞死（NETosis)，但其分子機理不太清楚，通過TNF-a、PMA、 LPS、IL-8等的刺激而產生，此時所產生的細胞死顯示出與古典的壞死或由所謂半胱天冬酶 的活化或DNA的片段化所引起的凋亡不同的形態。如果由LPS或PMA刺激中性粒細胞則產 生自噬，同時產生活性氧。由此而產生核膜的裂解、染色質的去解凝、組蛋白的瓜氨酸化，弓丨 起NETosis(非專利文獻1和2)。
[0003] 報道稱伴隨NETs的形成，由于脫顆粒而由中性粒細胞分泌很多蛋白質，尤其是嗜 天青顆粒或第2顆粒中所含的抗菌蛋白質，也分泌與細胞結構相關的蛋白質等（非專利文 獻2)。這些蛋白質也稱為NETs組分蛋白，報道有中性粒細胞彈性蛋白酶、組蛋白、髓過氧化 物酶、F-肌動蛋白、乳鐵蛋白、基質金屬蛋白酶9、LL37、組織蛋白酶G、BPI、蛋白酶3、鈣衛 蛋白、天青殺素（azurocidin)、溶菌酶C、防衛素、過氧化氫酶等（非專利文獻3)。
[0004] 乳鐵蛋白包含于中性粒細胞的第2顆粒中，中性粒細胞形成NETs，最終進行脫顆 粒，向周圍放出（非專利參考文獻1)。
[0005] 乳鐵蛋白在哺乳動物中很好保存，其功能未發現很大種類差異。另外，現在作為牛 奶成分的蛋白質其生理活性受到關注并在市場上銷售。然而，報道稱牛奶對牛的中性粒細 胞的NETs形成未顯示出抑制效果（非專利文獻4)。
[0006] NETs也與血栓的增大?生長有關，在放出NETs時，其中所含的組蛋白具有解凝血 小板的作用，以NETs為基礎形成血小板血栓。而且NETs中所含的中性粒細胞彈性蛋白酶 或組織蛋白酶G分解組織因子途徑抑制因子，促進血液凝固反應。由于這些作用而也顯示 出使微生物等限制在局部的作用（非專利文獻5)。
[0007] 原本NETs的作用是捕捉革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等外來微生物，將其 限制在局部進行殺菌。由于具有這樣的作用而在感染癥中多被發現，但也有報道稱隨著感 染癥等的慢性化，即使在外來微生物的不存在下也發現NETs的形成。已知作為慢性且難治 性的自身免疫疾病之一的系統性紅斑狼瘡（SLE)形成針對自身DNA或相關蛋白的自身抗 體，由此在組織或器官中引起炎癥。SLE的特征性表現在于中性粒細胞在障礙部位大量存 在。已知在SLE患者的血清中存在抗菌肽LL37和NETs中的DNA(非專利文獻6和7)。這 些作為自身抗原被B細胞識別而產生自身抗體。另外，SLE患者的中性粒細胞與正常人的中 性粒細胞相比易引起NETosis (非專利文獻6)。認為這些因素會引發慢性炎癥。另外，報道 稱即使在作為由自身抗體所致的疾病的抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA)相關血管炎中，患 者血清中的IgG級分也比正常人的IgG級分的中性粒細胞的NETs形成能力高約2倍（非 專利文獻8和9)。
[0008] 自2004年的Brinkman等人的報道（非專利文獻1)以來NETs形成與疾病關聯受 到關注，是最近的情況，今后可能會明確由NETs形成所致的新的疾病。由此，NETs形成對 于生物體的感染防御發揮了重要的作用，但也認為根據病情抑制NETs形成對于病情的改 善有時是有必要的。
[0009] 作為抑制NETs形成的物質，報道有，為了分解被放出的DNA網，肺炎鏈球菌或金黃 色葡萄球菌等革蘭氏陽性球菌的鏈球菌在菌體外使DNase表達。另外，作為針對組蛋白的 抗體或如抑制超氧化物產生那樣的物質報道有二苯基氯化碘鹽（DPI)或過氧化氫酶（非專 利文獻10)。
[0010] 其他，已知髓過氧化物酶（MPO)活性影響NETosis (非專利文獻11)、中性粒細胞 形成NETs并出現細胞死的現象，即NETosis是與凋亡或壞死不同的過程（非專利文獻10) 等。
[0011] 雖然有將源自奶的堿性蛋白質組分作為有效成分預防I型糖尿病或風濕性關節 炎的自身免疫疾病的現有技術（專利文獻1)，但其為專用于以淋巴細胞為中心的免疫細胞 的調節或炎癥性細胞因子的抑制等的內容，并非是涉及抑制NETs形成作用的技術。
[0012] 迄今為止，未報道治療由NETs形成所引起的疾病的藥劑。
[0013] 現有技術文獻
[0014] 專利文獻
[0015] 專利文獻1 :日本特開2008-189637
[0016] 非專利文獻
[0017]非專利文獻 I :Volker Brinkmann 等，2004Science，303 :1532-1535
[0018]非專利文獻 2 :Q Remi jsen 等，2011，Cell Death and Differentiation，18 : 581-588
[0019]非專利文獻 3 :Maren von Koeckritz-Blickwede 等，2008，Blood，111 :3070-3080
[0020] 非專利文獻 4 :John D. Lippolis 等，2006，Veterinary Immunology and Immunopathology，113 :248-255
[0021] 非專利文獻 5 :Fuchs TA 等，2010, Proc Natl Acad Sci USA，107 :15880-15885
[0022] 非專利文獻6:63代丨3-1?〇111〇65等，20115(^1'抑1181]^(1，3:73抑20.
[0023]非專利文獻 7 :Lande R 等，2011Sci Transl Med，3 :73ral9.
[0024]非專利文獻 8 :Kessenbrock K 等，2009, Nat Med，6 :623-625
[0025]非專利文獻 9 :Bosch X，2009, J Am Soc N印hrol，8 :1654-1656
[0026]非專利文獻 10 :Tobias A. Fuchs 等，2007, J Cell Biol，176 :231-241
[0027]非專利文獻 11 :K. Akong-Moore 等，2012, PLOS ONE，7 :e42984
[0028] 非專利文獻12 :內藤真等，2010,生物試樣分析，33 :329-338
【發明內容】
[0029] 發明要解決的問題
[0030] 本發明的目的在于提供一種由于白細胞的細胞外誘捕網形成而引發的疾病的根 本的治療藥、尤其是適合進行長期的維持緩解（抑制復發）的、安全且有效的治療藥及治療 方法。
[0031] 本發明人等為了解決上述課題進行了深入研究，結果發現：乳鐵蛋白顯著地發揮 NETs形成的抑制效果，可根本地治療NETs相關疾病。而且可知，在NETs形成疾病的ANCA 相關血管炎模型動物、局部施瓦茨曼反應模型動物和彌散性血管內凝血（DIC))模型動物 中也獲得顯著的存活率的改善。
[0032] 用于解決問題的方案
[0033] SP，本發明提供以下方案。
[0034] [1]-種白細胞的細胞外誘捕網形成抑制劑，其含有乳鐵蛋白。
[0035] [2]根據前述[1]所述的抑制劑，其中乳鐵蛋白是以0. 001~10g/kg/日的量的方 式制備的。
[0036] [3]根據前述[1]所述的抑制劑，其中所述乳鐵蛋白源自人。
[0037] [4]根據前述[1]所述的抑制劑，其中所述乳鐵蛋白為選自由以下（a)~（c)組成 的組中的任一個所述的蛋白質，
[0038] (a)包含序列號1~5中的任一個的氨基酸序列的蛋白質；
[0039] (b)包含在序列號1~5中的任一個的氨基酸序列中的缺失、置換、插入和/或添 加1~66個氨基酸的氨基酸序列，且具有抑制白細胞的細胞外誘捕網形成的活性的蛋白 質；
[0040] (c)具有與序列號1~5中的任一個的氨基酸序列具備90%以上的序列同源性的 氨基酸序列，且具有抑制白細胞的細胞外誘捕網形成的活性的蛋白質。
[0041][5]根據前述[1]~[5]中任一項所述的抑制劑，其中所述白細胞為選自由中性粒 細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞組成的組中的任一個。
[0042][6]根據前述[5]所述的抑制劑，其中所述白細胞為中性粒細胞。
[0043] [7] -種用于治療白細胞的細胞外誘捕網形成相關的疾病的組合物，所述組合物 含有乳鐵蛋白。
[0044] [8]根據前述[7]所述的組合物，其中乳鐵蛋白是以0. 001~10g/kg/日的量的方 式制備的。
[0045] [9]根據前述[7]所述的組合物，其中所述乳鐵蛋白源自人。
[0046] [10]根據前述[7]所述的組合物，其中所述乳鐵蛋白為選自由以下（a)~（c)組 成的組中的任一個所述的蛋白質，
[0047] (a)包含序列號1~5中的任一個的氨基酸序列的蛋白質；
[0048] (b)包含在序列號1~5中的任一個的氨基酸序列中的缺失、置換、插入和/或添 加1~66個氨基酸的氨基酸序列，且具有抑制白細胞的細胞外誘捕網形成的活性的蛋白 質；
[0049] (c)具有與序列號1~5中的任一個的氨基酸序列具備90%以上的序列同源性的 氨基酸序列，且具有抑制白細胞的細胞外誘捕網形成的活性的蛋白質。
[0050] [11]根據前述[7]~[10]中任一項所述的組合物，其中所述白細胞為選自由中性 粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞組成的組中的任一 個。
[0051] [12]根據前述[7]~[11]中任一項所述的組合物，其中所述疾病為選自由ANCA 相關血管炎、系統性紅斑狼瘡、局部施瓦茨曼反應、伴隨缺血再灌注損傷的急性腎功能損傷 (AKI)和彌散性血管內凝血組成的組中的任一個。
[0052] [13]根據前述[7]~[12]中任一項所述的組合物，其處于食品的形態。
[0053] [14]根據前述[7]~[12]中任一項所述的組合物，其處于注射劑的形態。
[0054] [15]根據前述[7]~[13]中任一項所述的組合物，其為口服給與。
[0055] [16] -種白細胞的細胞外誘捕網形成的抑制方法，其包括向患者給與乳鐵蛋白。
[0056] [17] -種白細胞的細胞外誘捕網形成相關的疾病的治療方法，其包括向患者給與 乳鐵蛋白。
[0057] 發明的效果
[0058] 本發明可提供針對于由白細胞的細胞外誘捕網形成所引起的疾病的副作用少的 治療方法。另外，由于副作用少，所以具有可安心用于較廣范圍的患者和潛在患者人群的優 點。
[0059] 本發明的抑制劑和組合物可廣泛用于高齡者、患癌患者等免疫力降低的受試者、 感染癥合併癥例、有肺結核病史的受試者等較廣泛的受試者人群。另外，提供即使長期使用 其副作用也少的、與白細胞的細胞外誘捕網形成相關的疾病的治療藥和治療方法。尤其是 在治療所述疾病中需要長期使用藥劑的情況下，作為急性期癥狀緩解后的受試者的復發抑 制劑、以及作為所述疾病慢性化后的治療藥是有用的。
【附圖說明】
[0060] 圖I-A是表不基于牛乳鐵蛋白的NETs形成抑制能力的圖。
[0061] 圖I-B是表示基于人乳鐵蛋白的NETs形成抑制能力的圖。
[0062] 圖I-C是表示人乳鐵蛋白抑制NETs形成的狀態的熒光顯微鏡照片。
[0063] 圖I-D是表示由人乳鐵蛋白抑制伴隨NETs的DNA放出的效果的圖。
[0064] 圖I-E是表示由人乳鐵蛋白抑制伴隨NETs的DNA放出的狀態的電子顯微鏡照片。
[0065] 圖2是表示由人乳鐵蛋白抑制伴隨NETs的DNA放出的效果的圖。
[0066] 圖3是表示通過牛乳鐵蛋白的口服給與而使ANCA相關血管炎模型動物的存活率 上升的效果的圖。
[0067] 圖4-A是表示通過牛乳鐵蛋白的口服給與而使ANCA相關血管炎模型動物的血中 MPO-ANCA抗體效價降低的效果的圖。
[0068] 圖4-B是表示通過牛