Fam3c的反義核苷酸在制備抑制上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移的藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及序列相似性蛋白家族3成員C(FAM3C)的反義核苷酸的新用途，具體涉 及FAM3C的反義核苷酸在制備抑制上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移的藥物中的應用，屬于腫瘤 生物治療技術領域。
【背景技術】
[0002] 卵巢癌的致死率位居所有婦科腫瘤的首位，是一種嚴重危害女性生命健康的疾 病。卵巢癌按照其來源不同分為：上皮性卵巢癌、性索間質性卵巢癌、生殖細胞性卵巢癌和 轉移性卵巢癌，而上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常見的類型，約占所有卵巢癌病例的90%。由 于卵巢癌早期缺乏明顯的臨床表現，因此往往被拖延，直至出現侵襲轉移，發展為晚期才被 首次診斷。在臨床，約75%的患者被確診為卵巢癌晚期，盡管臨床針對早期卵巢癌患者的治 療效果尚可，但是對晚期患者的治療效果則十分有限。
[0003] 腫瘤轉移是引起臨床腫瘤治療失敗和患者死亡的關鍵因素之一，在卵巢癌中，月中 瘤轉移的意義更為突出。根據國際婦產聯合會（FIGO)的分期標準，腫瘤的轉移，尤其是在 腹腔中的轉移，是卵巢癌發展進入晚期的標志之一。因此，侵襲轉移極大地推進了卵巢癌發 展的進程，增加了腫瘤的惡性程度，降低腫瘤患者的生存期。因此，針對卵巢癌侵襲轉移的 干預策略能夠為臨床治療該腫瘤提供新思路。
[0004] 越來越多的研究顯示，上皮-間質轉化（EMT)可以在多種腫瘤，包括上皮性卵巢癌 中促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，并且臨床數據顯示上皮-間質轉化與卵巢癌患者的不良預 后有顯著的關聯。說明上皮-間質轉化在卵巢癌中能夠調節腫瘤的侵襲轉移并發揮重要作 用。
[0005] 序列相似性蛋白家族3成員C (FAM3C)在2006年首次被報道能夠誘導鼠乳腺上皮 細胞發生上皮-間質轉化，因此也被命名為白介素類似的上皮-間質轉化誘導因子（ILEI)。 有文獻報道FAM3C與結直腸癌的上皮-間質轉化表型具有相關性，提示其在人類腫瘤中同 樣是一個潛在的上皮-間質轉化促進因子，但FAM3C與卵巢癌的關系尚未見報道。人FAM3C 基因位于染色體7q31，我們前期的研究表明，其在正常的卵巢組織中表達量很低，但在上皮 性卵巢癌尤其是轉移灶中表達量明顯升高，提示FAM3C與卵巢癌的侵襲轉移密切相關。
[0006] 目前臨床針對上皮性卵巢癌的治療采用包括手術切除或減瘤，輔以紫杉醇和鉑類 藥物的聯合化療等傳統治療方法，缺乏較強的特異性。針對腫瘤細胞的特點進行特異性治 療，有的放矢，可以提高腫瘤治療的敏感性和特異性。本發明發明人發現通過靶向基因沉默 FAM3C基因的表達，可以反轉卵巢癌中上皮-間質轉化過程并抑制腫瘤細胞的迀移和侵襲 能力，是一種特異性的腫瘤生物治療策略，可以為臨床提供針對FAM3C高表達的上皮性卵 巢癌侵襲轉移治療手段研發的基礎。
【發明內容】
[0007] 目前，臨床針對卵巢癌轉移的治療效果有限，因此提供一種靶向穩定沉默基因 FAM3C的生物治療策略，通過反義核苷酸序列沉默FAM3C基因的表達，能夠特異性地阻斷上 皮性卵巢癌發生上皮-間質轉化（EMT)，進而抑制卵巢癌的侵襲和轉移的進程。
[0008] 為了達到以上目的，本發明所采用的技術方案為：
[0009] 本發明的技術方案針對上皮性卵巢癌，應用慢病毒轉染反義核苷酸序列對腫瘤細 胞中FAM3C基因進行靶向穩定沉默，有效抑制FAM3C基因在RNA和蛋白水平上的表達，從而 引起上皮-間質轉化的逆轉以及腫瘤細胞迀移和侵襲能力的下降。
[0010] 1.上皮性卵巢癌細胞的常規培養
[0011] 選擇人上皮性卵巢癌細胞0VCAR3作為研究對象，該細胞系購自美國標準生物品 收藏中心（ATCC)，具有相對較高的FAM3C基因的表達基礎。
[0012] 2.應用反義核苷酸序列對FAM3C基因進行靶向穩定沉默
[0013] 選擇使用兩條針對FAM3C基因的不同的反義核苷酸序列以及其相應的對照序列 構建成的慢病毒質粒（購自廣州復能基因有限公司）作為材料。
[0014] (1)人胚胎腎細胞293TN的常規培養；
[0015] (2)利用FAM3C靶向反義核苷酸序列和對照序列的質粒進行慢病毒包裹；
[0016] 使用Lenti_Pac?HIVExpressionPackagingKit(購自廣州復能基因有限公司） 進行慢病毒的包裹；
[0017] (3)利用包裹好的慢病毒上清液分別感染上皮性卵巢癌0VCAR3細胞；
[0018] (4)應用嘌呤霉素對感染后的0VCAR3細胞進行藥物篩選，獲得穩定感染的細胞克 隆。
[0019] 3. FAM3C穩定沉默后的表達情況檢測
[0020] (1)利用半定量RT-PCR技術在RNA水平檢測穩定沉默后對照細胞克隆和FAM3C穩 定沉默后的兩個實驗組細胞克隆的基因沉默效果；
[0021] (2)利用Western Blot技術在蛋白水平檢測穩定沉默后對照細胞克隆和FAM3C穩 定沉默后的兩個實驗組細胞克隆的基因沉默效果。
[0022] 4.檢測FAM3C基因穩定沉默后對細胞EMT過程的影響
[0023] 通過檢測細胞中上皮以及間質細胞標志物的表達情況可以判斷細胞上皮-間 質轉化的進程。我們運用Western Blot的方法，選擇上皮細胞標志物E-cadherin、 0ccludin(均購自Santa Cruz公司）和間質細胞標志物N-CadheriruVimentin(購自BD公 司）和Twist (購自Abcam公司），對這些分子的蛋白水平進行檢測。
[0024] 5?檢測FAM3C基因穩定沉默后對細胞迀移能力和侵襲能力的影響
[0025] (1)運用劃痕愈合實驗（Wound-Healing)檢測FAM3C基因穩定沉默后的細胞克隆 相對于對照組克隆在迀移能力上的改變；
[0026] (2)運用人工基底膜侵襲實驗檢測FAM3C基因穩定沉默后的細胞克隆相對于對照 組克隆在細胞侵襲能力上的改變；
[0027] 應用BDBioCoat?Matrigel?InvasionChamber(購自BD公司）進行人工基底膜 侵襲實驗。
[0028] 以上方案可以有效地在上皮性卵巢癌細胞中靶向沉默FAM3C，使其在細胞中RNA 和蛋白水平的表達明顯下降；在穩定沉默FAM3C后，可以檢測到腫瘤細胞發生了從間質細 胞形態到上皮細胞形態的轉變，即上皮-間質轉化的逆過程，并且顯著地抑制了腫瘤細胞 的迀移和侵襲的能力。
[0029] 在此研究的基礎上，本發明提供了序列相似性蛋白家族3成員C(FAM3C)的反義 核苷酸的一種新的用途，即序列相似性蛋白家族3成員C(FAM3C)的反義核苷酸在制備抑 制上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移的藥物中的應用，其中，所述的序列相似性蛋白家族3成員 C(FAM3C)的序列如SEQIDN0:1 或SEQIDN0:2 所示。
[0030] 在本發明中，優選的，所述的上皮性卵巢細胞為上皮性卵巢癌0VCAR3細胞。
[0031] 在本發明中，優選的，所述的藥物是通過靶向沉默上皮性卵巢癌細胞中FAM3C基 因的表達，特異性阻斷上皮性卵巢癌細胞發生上皮-間質轉化，進而達到抑制上皮性卵巢 癌細胞侵襲轉移的目的。
[0032] 本發明取得的有益效果：
[0033] 本發明針對腫瘤轉移在上皮性卵巢癌臨床進程中的重要推進作用，提出了一種靶 向特異性抑制FAM3C基因的生物治療方法。通過使用反義核苷酸序列對上皮性卵巢癌細胞 中FAM3C基因表達的靶向沉默，可以有效地阻斷上皮性卵巢癌細胞的EMT轉化，并有效抑制 腫瘤細胞的迀移和侵襲能力，以實現在上皮性卵巢癌中有針對性地對腫瘤轉移進行干預， 降低腫瘤的進展及惡性程度，提高患者的生存率及預后。
【附圖說明】
[0034] 圖1是用RT-PCR技術檢測FAM3C基因沉默后與對照組相比RNA水平表達下降的 情況圖；其中，shctrl :對照組，seql :反義核苷酸序列1，seq3 :反義核苷酸序列3 ;
[0035] 圖2是用Western Blot技術檢測FAM3C基因沉默后與對照組相比蛋白水平表達 下降的情況圖；其中，shctrl :對照組，seql :反義核苷酸序列1，seq3 :反義核苷酸序列3 ;
[0036] 圖3是用Western Blot技術檢測FAM3C基因沉默后與對照組相比上皮、間質標志 物蛋白水平的表達改變圖；其中，shctrl :對照組，seql :反義核苷酸序列l，seq3 :反義核苷 酸序列3;
[0037] 圖4是對FAM3C基因沉默后與對照細胞相比劃痕實驗的結果圖（倒置相差顯微鏡 下觀察拍攝的圖片）；其中，其中，shctrl :對照組，seq3 :反義核苷酸序列3 ;
[0038] 圖5是利用Image J軟件測量劃痕實驗的拍攝圖片，以統計柱狀圖表示FAM3C基 因沉默后與對照細胞相比，劃痕覆蓋百分比的情況圖；其中，shctrl :對照組，seq3 :反義核 苷酸序列 3, * * * :P〈0. 001 ;
[0039] 圖6是人工基底膜侵襲實驗中FAM3C基因沉默后與對照細胞相比，24小時后侵襲 的穿膜細胞的顯微鏡下拍攝圖片；其中，shctrl :對照組，seql:反義核苷酸序列l，seq3:反 義核苷酸序列3;
[0040] 圖7用統計柱狀圖表示人工基底膜侵襲實驗中FAM3C基因沉默后與對照細胞相 比，穿膜細胞的數量變化圖；其中，shctrl :對照組，seql:反義核苷酸序列1，seq3:反義核 苷酸序列 3, * * * :P〈0. 001。
【具體實施方式】
[0041] 下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例 僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。
[0042]試驗例1
[0043] 1.上皮性卵巢癌腫瘤細胞的常規培養
[0044] 選擇人上皮性卵巢癌細胞0VCAR3作為研究對象，該細胞系購自美國標準生物品 收藏中心（ATCC)，具有相對較高的FAM3C基因的表達基礎。在37 °C恒溫孵箱中，5 % (：02濃 度的條件下，以含10%胎牛血清（FBS，購自PAA公司）的RPMI-1640培養基進行培養。
[0045] 2.應用反義核苷酸序列對FAM3C基因進行靶向穩定沉默
[0046] 使用的FAM3C基因沉默shRNA克隆質粒中包含的兩條反義核苷酸序列如下：
[0047] Seql:GATGTGGCACCATTTATTG(SEQID N0:1 所示）；
[0048] Seq3 :ATGGAGCAACCAAACTCAA(SEQ ID N0:2 所示）。
[0049] (1)人胚胎腎細胞293TN的常規培養
[0050] 在37°C恒溫孵箱中，5% 0)2濃度的條件下，以含10%胎牛血清（FBS，購自PAA公 司）的DMEM培養基進行培養。
[0051] (2)利用FAM3C靶向反義核苷酸序列和對照序列的質粒進行慢病毒包裹