一種葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復合藥物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明專利涉及介孔材料制備與藥物制劑技術領域，具體涉及一種葉酸修飾的雄 黃-介孔氧化硅納米復合藥物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 礦物藥雄黃（Realgar)，為中醫學中應用歷史悠久的中藥，最早載于《神農本草 經》，主要成分為四硫化四砷（As 4S4),并夾雜少量砒霜（As2O3)及其它重金屬鹽，用于解毒 殺蟲，燥濕，去痰，截瘧等。自20世紀50年代以來，國內許多學者將含雄黃的復方制劑或 單味雄黃用于臨床治療血液系統的腫瘤及人體其他部位的腫瘤，取得了很好的療效。且由 于其毒性低于砒霜注射劑，雄黃被推薦為治療急性早幼粒細胞白血病（APL)的二線化療 M(Wu J Z, Shao Y B, Liu J L, et al. The medicinal use of realgar (As4S4) and its recent development as ananticancer agent[J]. Journal ofEthnopharmacology,2011,135 (3)： 595-602)。目前研究證明雄黃抗腫瘤作用的機理為誘導細胞凋亡、誘導細胞分化、抑制核酸 合成、作為血管內皮細胞抑制劑和直接細胞毒作用等（劉嶸，濮德敏.雄黃的研究進展[J]. 時珍國醫國藥，2007,18(4) :982-984)。但是雄黃為硫化物類礦物，難溶于水及大部分有機 溶劑，目前的臨床應用中一直存在口服劑量大、潛在毒性大等問題。
[0003] 目前通常采用氣流和球磨等微粉化技術將雄黃粒徑減小到微、納米級尺度水平， 提高其生物利用度，但現有這些方法仍然存在不少缺點，例如：粒徑難以控制、穩定性差、水 溶性差、易發生氧化和團聚等。楊祥良等（Yang X L，Xu H B，Ye H Q，et al. Nanometer realgar solid dispersion and its preparation method :China，CN1478486[P]. 2004-03-03)以納 米雄黃為活性成分，以高分子聚合物為載體，添加抗氧化劑和表面活性劑，通過熔融法和溶 劑揮發法制備了納米雄黃固體分散體，解決了納米雄黃的氧化與團聚問題。沈星燦等（Shen X C, Liang H, Chen Y, et al. Method for preparing nanometer realgar gel and nanometer realgar with biomacromolecule template to regulate shape and particle thereof ： China, CN100374463C[P]. 2008-03-12)采用化學法，以生物大分子為模板調控形貌與粒徑 制得不同形貌與粒徑的納米雄黃。然而上述方法制備的納米雄黃在殺死腫瘤細胞的同時對 正常細胞也有一定的毒副作用。
[0004] 葉酸受體在大部分人體腫瘤細胞上都存在過度表達（Morelli C，Maris P，Sisci D, et al. PEG-templated mesoporous silica nanoparticles exclusively target cancer cells [J]. Nanoscale，2011，3 (8) :3198-3207)，因此，在藥物制劑設計中通常將葉酸作 為主動靶向識別配體。而介孔氧化硅納米粒子表面具有豐富的可接支位點，易于葉酸修 飾，同時該載體具有高的負載量、形貌可控性以及低的系統毒性等優點（Tang F Q，Li L L, Chen D. Mesoporous silica nanoparticles ：synthesis, biocompatibility and drug delivery [J] ? Advanced Materials, 2012, 24 (12) :1504-1534)，并且使雄黃能在納米水平 均一分散于介孔腔，因此選擇其作為雄黃靶向輸送載體具有良好的可行性。
【發明內容】
[0005] 本發明公開了一種葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子，它具有大比表面積和孔體 積、孔徑分布窄、粒徑均勻以及單分散的球形形貌，適合作為藥物載體，在藥物傳遞領域具 有良好的應用前景。
[0006] 本發明的葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子能夠通過物理吸附負載雄黃，形成葉酸 修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復合藥物，期望其靜注后通過與腫瘤細胞表面的葉酸受體特 異性結合，選擇性地在腫瘤部位累積并被細胞吞噬，降低雄黃對正常細胞的毒副作用，并實 現有效的治療作用。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：以正硅酸四乙酯為硅源，十六烷基 三甲基溴化銨為模板劑，乙醇為助溶劑，三乙醇胺為螯合劑在堿性條件下合成介孔氧化硅 納米粒子，經溶劑萃取法除去模板劑后通過后嫁接法在其表面鍵合氨丙基，再通過偶聯反 應修飾葉酸，即得到葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子。然后將雄黃溶于無水乙二胺形成簇 溶液（As 4S4-NH2C2H4NH 2)，離心除去其他不溶性礦物成分，再用去離子水稀釋，配制成一定濃 度的雄黃乙二胺溶液，通過高速振蕩的方式負載于葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子的孔道 中，即得葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復合藥物。
[0008] 葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復合藥物的合成過程如下：
[0009] 上述制備方法中正硅酸四乙酯：十六烷基三甲基溴化銨：三乙醇胺：水：乙醇 的摩爾比為1 : 0.2~0.3 : 0.8~LO : 130~150 : 7.0~13.0。在此范圍內，通過 改變正硅酸四乙酯與三乙醇胺或者正硅酸四乙酯與乙醇的比例可以得到不同粒徑大小的 介孔氧化娃納米粒子。
[0010] 雄黃-介孔氧化硅納米復合物的制備方法中：乙二胺：水的體積比為1 : 0. 33~ 1 : 3,雄黃濃度為2~20mg/mL，載體量為5~20mg，負載時間為0~4小時。
[0011] 更為優選的制備方法如下：
[0012] a.室溫下，稱取適量陽離子表面活性劑置于圓底燒瓶中，加入去離子水后于40~ 80°C加熱攪拌，溶解后依次加入無水乙醇和三乙醇胺，攪拌均勻后逐滴加入正硅酸四乙酯， 保持40~80°C繼續攪拌1~3小時；
[0013] b.將反應混合物離心，用去離子水洗至中性，再用無水乙醇洗滌后于60°C真空干 燥；
[0014] C.用含鹽酸的乙醇溶液除去模板劑，60°C真空干燥，得到介孔氧化硅納米粒子；
[0015] d.室溫下，稱取適量介孔氧化硅納米粒子置于圓底燒瓶中，加入無水乙醇攪拌分 散，量取適量3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解于無水乙醇后加入上述圓底燒瓶，室溫攪拌40~ 60小時；
[0016] e.將反應混合物離心，用無水乙醇洗滌后置60°C真空干燥，得到氨基化的介孔氧 化石圭納米粒子；
[0017] f.室溫下，稱取適量葉酸于圓底燒瓶中，加入二甲亞砜超聲溶解，依次加入N-羥 基丁二酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光攪拌1小時后加 入適量氨基化的介孔氧化硅納米粒子，繼續避光攪拌10~30小時；
[0018] g.將反應混合物離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌后真空干燥，得到葉酸修飾的介孔氧 化石圭納米粒子。
[0019] h.將雄黃溶于無水乙二胺，溶解后離心除去不溶性礦物成分，再用去離子水稀釋， 使得乙二胺：水的體積比為1 : 0. 33~1 : 3,配制成雄黃濃度為2~20mg/mL的雄黃乙 二胺溶液；
[0020] i.稱取5~20mg介孔氧化硅納米粒子置于塑料離心管中，加入上述雄黃乙二胺溶 液，室溫下置于高速振蕩器振蕩0~4小時；
[0021] j.離心，用去離子水洗滌，合并上清液并轉移至三角燒瓶中進行濕法消解，用原子 熒光光譜儀測定負載前后樣品中砷濃度的變化，根據標準曲線計算雄黃負載量。
[0022] k.用葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子替換i中的介孔氧化硅納米粒子，用優化得 到的條件考察其對雄黃的負載量。
[0023] 本發明的創造性在于：
[0024] 1.本發明中的介孔氧化硅材料的制備使用三乙醇胺來絡合硅物種，該制備方法與 稀溶液法以及微乳法相比合成過程簡單，產率高，后處理方便。
[0025] 2.本發明制備的介孔氧化硅納米粒子具有蠕蟲狀孔道的球形形貌，粒徑均一，約 為80~IOOnm,見圖1，比表面積和孔體積分別為973m 2/g和I. 01cm3/g，具有有序的介孔結 構，窄的孔徑分布，見圖2至圖4,該材料表面具有較多的活性位點，易于被修飾，同時具有 高的負載量、形貌可控性以及低的系統毒性等優點，適合作為藥物載體。
[0026] 3.介孔氧化硅納米粒子作為藥物載體是近十年來的研究熱點，但通常都是負載傳 遞分子類藥物，負載礦物藥雄黃的研究還未見文獻報道。本發明通過考察乙二胺與水的體 積比，雄黃乙二胺溶液的濃度，載體量以及振蕩時間發現，介孔氧化硅納米粒子對雄黃有一 定的負載能力，見圖6至圖9,且其形貌和結構未發生明顯的改變，見圖10,負載量約為8%， 圖11是雄黃-介孔氧化硅納米復合物的能譜分析圖，進一步說明雄黃在納米水平負載于介 孔氧化硅納米粒子中，在其表面修飾葉酸后形成葉酸修飾的雄黃-介孔氧化硅納米復合藥 物，但其靶向特性還需進一步經過體外細胞實驗驗證。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的透射電鏡（TEM)照片；
[0028] 圖2為實施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的小角X射線衍射（XRD)圖譜；
[0029] 圖3為實施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的氮氣吸附-脫附等溫線曲線；
[0030] 圖4為實施例1合成的介孔氧化硅納米粒子的孔徑分布曲線；
[0031] 圖5為實施例3合成的葉酸修飾的介孔氧化硅納米粒子的紅外光譜圖；
[0032] 圖6為實施例4中乙二胺與水體積比與載藥率的關系曲線；
[0033] 圖7為實施例5中雄黃濃度與載藥率的關系曲線；
[0034] 圖8為實施例6中載體的量與載藥率的關系曲線；
[0035] 圖9為實施例7中振蕩時間與載藥率的關系曲線；
[0036] 圖10為實施例8中雄黃-介孔氧化硅納米復合藥物的透射電鏡（TEM)照片；
[0037] 圖11為實施例8中雄黃-介孔氧化硅納米復合藥物的能譜分析（EDX)圖譜
【具體實施方式