Il-17在提高間充質干細胞免疫抑制功能中的應用

            文檔序號:9360045閱讀:782來源:國知局
            Il-17在提高間充質干細胞免疫抑制功能中的應用
            【技術領域】
            [0001] 本發明屬于生物醫藥領域,具體地說,本發明涉及IL-17在提高間充質干細胞免 疫抑制功能中的應用。
            【背景技術】
            [0002] 間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干細胞家族的重要成員,來源于 發育早期的中胚層和外胚層,屬于多能干細胞,MSC最初在骨髓中發現,因其具有多向分化 潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如 間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下,可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、 神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞,連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能,可 作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。
            [0003] 無論在體內實驗還是在體外實驗中,MSC對于T細胞的免疫抑制機制已經得到了 廣泛的研究,目前普遍認為MSC對于T細胞的抑制不是通過誘導T細胞凋亡,而是使得T細 胞的細胞周期停留在G0/G1期。也有研究表明MSC可以促進激活的T細胞的凋亡,但可以 促進靜息狀態下的T細胞的存活,這也說明MSC發揮免疫抑制依賴于T細胞活化時所釋放 的炎癥細胞因子的刺激。
            [0004] 白介素-17A (interleukin 17A,IL-17A,白細胞介素17,簡稱為IL-17)是目前已 發現的30余種白細胞介素之一,按序號排在第17位。IL-17由⑶4+T細胞分泌,能夠誘導 上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞合成分泌IL-6、IL-8、G-CSF、PGE2,促進ICAM-I的表達。 近年來發現IL-17是一種主要由活化的T細胞產生的致炎細胞因子,可以促進T細胞的激 活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生多種細胞因子如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬 細胞刺激因子(GM-CSF)和化學增活素及細胞黏附分子I (cellular adhesion molecule 1,CAM-1),從而導致炎癥的產生。IL-17是T細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因子,可以通 過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應。IL-17與受體結合后,可通過MP激酶途徑和 核轉錄因子kB(nuclearfactor kB,NF-kB)途徑發揮其生物學作用。Thl7細胞能夠分泌產 生11^-17厶、11^-17?、11^-6以及腫瘤壞死因子<1(1:111]1〇1'116(31'〇818€&(31:〇抑,1即-(1)等,這些 細胞因子可以集體動員、募集及活化中性粒細胞。Thl7細胞產生的IL-17能有效地介導中 性粒細胞動員的興奮過程,從而有效地介導了組織的炎癥反應。
            [0005] IL-17作為一種促炎癥細胞因子,能夠作用于多種細胞類型,進而促進其他一些細 胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶的表達,包括TNFa、IL-IP、IL-6、GM-CSF、G-CSF、CXCL1、 MMP-3等。同時,IL-17還可以和其他一些細胞因子如TNFa協同促進多種靶基因的表達。 體內的實驗研究揭示了 IL-17家族細胞因子在機體抗微生物感染中所發揮的重要作用。盡 管IL-17在機體細菌和真菌感染中起到保護作用,但是IL-17信號通路的過度激活則會導 致自身免疫病的發生。在人自身免疫病中,IL-17是明顯上升的,許多研究表明IL-17參與 了諸多自身免疫病的發病進程,包括MS (多發性硬化)、RA (類風濕性關節炎)和IBD (炎癥 性腸病)。

            【發明內容】

            [0006] 本發明的目的在于提供白介素-17、白介素-17的衍生物或其激動劑的用途。
            [0007] 本發明的另一目的是提供白介素-17拮抗劑的用途。
            [0008] 本發明的另一目的是提供一種經IL-17處理的提高了免疫抑制能力的間充質干 細胞。
            [0009] 本發明的第一方面,提供了一種白介素-17、白介素-17的衍生物或其激動劑的用 途,用于制備制劑或試劑盒,所述制劑或試劑盒用于:
            [0010] (1)提高間充質干細胞的免疫抑制功能;和/或
            [0011] ⑵上調MSC中免疫抑制因子的表達;和/或
            [0012] (3)增強MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩定性;和/或
            [0013] (4)降低RNA結合蛋白AUFl的表達水平;和/或
            [0014] (5)抑制T細胞的增殖;和/或
            [0015] (6)治療肝炎或肝損傷。
            [0016] 在另一優選例中,所述白介素-17是哺乳動物的白介素-17。
            [0017] 在另一優選例中,所述白介素-17是人白介素-17。
            [0018] 在另一優選例中,所述白介素-17的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
            [0019] 在另一優選例中,所述白介素-17的衍生物包括經修飾的白介素-17分子、氨基酸 序列與天然白介素-17同源且具有天然白介素-17活性的蛋白分子、白介素-17的二聚體 或多聚體、含有白介素-17氨基酸序列的融合蛋白。
            [0020] 在另一優選例中,所述經修飾的白介素-17分子是PEG化的白介素-17。
            [0021] 在另一優選例中,所述"氨基酸序列與天然白介素-17同源且具有天然白介素-17 活性的蛋白分子"是指其氨基酸序列與SEQ ID NO. :1相比具有彡85%的同源性,較佳地 彡90%的同源性,更佳地多95%的同源性,最佳地多98%同源性;并且具有天然白介素-17 活性的蛋白分子。
            [0022] 在另一優選例中,所述"間充質干細胞的免疫抑制功能"是指間充質干細胞對T細 胞的免疫抑制功能。
            [0023] 在另一優選例中,所述的制劑或試劑盒中還包含IFN Y和/或TNF a。
            [0024] 在另一優選例中,所述激動劑是指能夠在體內或體外提高白介素-17或其衍生物 的活性和/或含量的物質。所述物質可以為人工合成的或天然的化合物、蛋白、核苷酸等。
            [0025] 在另一優選例中,所述MSC細胞為骨髓來源的MSC細胞、臍帶來源MSC細胞、脂肪 來源MSC細胞、胎盤來源MSC細胞、和/或牙髓來源MSC細胞。
            [0026] 在另一優選例中,所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎;所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導性肝損傷、肝纖維化、肝硬化。
            [0027] 在另一優選例中,所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
            [0028] 本發明的第二方面,提供了一種白介素-17拮抗劑的的用途,用于制備制劑或試 劑盒,所述制劑或試劑盒用于:
            [0029] (1)降低間充質干細胞的免疫抑制功能;和/或
            [0030] (2)下調MSC中免疫抑制因子的表達;和/或
            [0031] (3)降低MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩定性;和/或
            [0032] (4)增強RNA結合蛋白AUFl的表達水平;和/或
            [0033] (5)促進T細胞的增殖。
            [0034] 在另一優選例中,所述白介素-17的拮抗劑是指能夠降低體內或體外白介素-17 活性的物質。
            [0035] 在另一優選例中,所述白介素-17的拮抗劑可以為小miRNA、抗白介素-17抗體或 iNOS抑制劑、Actl蛋白抑制劑、AUFl蛋白激動劑、白介素-17受體的抑制劑、NF K B抑制劑、 TRAF6抑制劑。
            [0036] 在另一優選例中,所述的制劑包括藥物組合物、保健品組合物、食品組合物、或實 驗試劑。
            [0037] 在另一優選例中,所述MSC細胞為骨髓來源的MSC細胞、臍帶來源MSC細胞、脂肪 來源MSC細胞、胎盤來源MSC細胞、和/或牙髓來源MSC細胞。
            [0038] 在另一優選例中,所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
            [0039] 本發明的第三方面,提供了一種組合物,所述組合物包括白介素-17或其衍生物、 IFN Y 和 TNF a 0
            [0040] 在另一優選例中,所述白介素-17或其衍生物、IFNy和TNFa的摩爾比為:1-1〇 : 10 :10〇
            [0041] 在另一優選例中,所述組合物包括固態制劑、液態制劑,較佳地為干粉或溶液形 式。
            [0042] 在另一優選例中,所述的組合物為藥物組合物。
            [0043] 本發明的第四方面,提供了一種分離的MSC細胞群,所述MSC細胞群由MSC細胞構 成或基本上由MSC細胞構成,并且所述的MSC細胞具有增強的抑制T細胞增殖的能力,
            [0044] 并且,所述的MSC細胞選自下組:
            [0045] (1)體外經預處理的MSC細胞群,其中所述預處理指用⑴白介素-17或其衍生 物、(ii)IFNy和(iii)TNFa同時、依次或先后進行處理;
            [0046] (2)Actl蛋白過表達和/或AUFl蛋白缺失或活性降低的細胞群;和
            [0047] (3)體外經預處理的MSC細胞群,其中所述預處理指用IFN Y和TNF a進行處理;
            [0048](4)組(1)、組⑵和組⑶的組合。
            [0049] 在另一優選例中,所述預處理中,條件如下:0? 5-1000ng/ml (較佳地l-200ng/ml, 更佳地 l-20ng/ml,最佳地 l-10ng/ml)的 IFN y、0? 5-1000ng/ml (較佳地 l_200ng/ml,更佳 地 l-20ng/ml,最佳地 l-10ng/ml)的 TNF a,和 〇? 2-1000ng/ml (較佳地 0? 5-200ng/ml,更佳 地 l-20ng/ml,最佳地 l-10ng/ml)白介素-17。
            [0050] 在另一優選例中,所述預處理中,使用l_2ng/ml IFNy、l-2ng/ml TNFa和 0.5_2ng/ml 白介素-17;或使用 10ng/ml IFNy、10ng/ml TNFa 和 l〇ng/ml 白介素-17。
            [0051]在另一優選例中,所述的增強的抑制T細胞增殖的能力指11/10彡1. 5 (較佳地 彡2,更佳地彡4),其中,Il為所述MSC細胞對T細胞增殖的百分比抑制率;而IO為對照 組的同物種的野生型的MSC細胞對T細胞增殖的百分比抑制率。
            [0052] 在另一優選例中,所述的"基本上由…構成"指MSC細胞占所述細胞群中細胞總數 的至少90 %,較佳地至少95 %,更佳地至少99 %。
            [0053] 在另一優選例中,所述MSC細胞群具有以下特征:將所述MSC細胞群施用于動物 后,可導致所述動物體內發生選自下組的變化:
            [0054] (a)血清ALT的水平下降;
            [0055] (b)肝臟中單個核細胞下降;
            [0056] (c) CD4+T細胞數下降;和/或
            [0057] (d)CD8+T細胞數下降。
            [0058] 在另一優選例中,
            [0059] (a)血清ALT的水平下降50 %~80 %;
            [0060] (b)肝臟中單個核細胞下降50 %~80 %;
            [0061] (c)CD4+T細胞數下降50 %~80%;和/或
            [0062] (d) CD8+T 細胞數下降 50 % ~75 %。
            [0063] 在另一優選例中,所述預處理過程包括步驟:
            [0064] 胰酶消化MSC細胞后,先培養至細胞貼壁,然后加入上述濃度的細胞因子,繼續培 養6-24小時后,再消化收集細胞群。
            [0065] 在另一優選例中,所述MSC細胞為骨髓來源的MSC細胞、臍帶來源MSC細胞、脂肪 來源MSC細胞、胎盤來源MSC細胞、和/或牙髓來源MSC細胞等。
            [0066] 本發明的第五方面,提供了一種遺傳改造的細胞株,所述細胞株是經基因工程改 造從而導致內源的Actl蛋白過表達和/或AUFl蛋白缺失或活性降低。
            [0067] 在另一優選例中,所述細胞株為哺乳動物MSC細胞株。
            [0068] 在另一優選例中,所述細胞株用于增強間充質干細胞的免疫抑制功能。
            [0069] 本發明的第六方面,提供了一種分離的蛋白復合物,所述蛋白復合物為Actl蛋白 和AUFl蛋白結合的蛋白復合物。
            [0070] 在另一優選例中,所述蛋白復合物分子量在80KD~130KD。
            [0071] 本發明的第七方面,提供了本發明第六方面所述蛋白復合物的應用,所述用途為 用于篩選藥物或化合物,所述藥物或化合物促進或抑制Actl蛋白和AUFl蛋白形成所述的 復合物。
            [0072] 在另一優選例中,所述的藥物用于:
            [0073] (1)提高間充質干細胞的免疫抑制功能;和/或
            [0074] (2)上調MSC中免疫抑制因子的表達;和/或
            [0075] (3)增強MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩定性;和/或
            [0076] (4)降低RNA結合蛋白AUFl的表達水平;和/或
            [0077] (5)抑制T細胞的增殖;和/或
            [0078] (6)治療肝炎或肝損傷。
            [0079] 在另一優選例中,當應用所述蛋白復合物篩選藥物時,所述應用包括步驟:
            [0080] (a)將目標物質與MSC細胞共培養;
            [0081] (b)檢測培養的細胞中所述蛋白復合物的含量。當細胞中所述蛋白復合物含量較 空白對照升高時,則該物質為陽性候選物質。
            [0082] 在另一優選例中,所述的篩選中還包括陽性對照組,較佳地所述的陽性對照組中 添加IL17。(實驗表明,IL17能增強兩個蛋白的結合形成復合物的能力。)
            [0083] 在另一優選例中,所述MSC細胞為骨髓來源的MSC細胞、臍帶來源MSC細胞、脂肪 來源MSC細胞、胎盤來源MSC細胞、和/或牙髓來源MSC細胞。
            [0084] 在另一優選例中,所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎;所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導性肝損傷、肝纖維化、肝硬化。
            [0085] 在另一優選例中,所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
            [0086] 本發明的第八方面,提供了一種試劑盒,所述試劑盒中含有以下組分:
            [0087] (a)白介素-17或其衍生物;
            [0088] (b)IFNy;和
            [0089] (c) TNF a;
            [0090]以及使用說明書,
            [0091]其中,所述的組分(a)、(b)和(C)分別位于一個或多個不同的容器或位于同一容 器中。
            [0092] 在另一優選例中,所述的說明書中描述:所述試劑盒用于
            [0093] (1)提高間充質干細胞的免疫抑制功能;和/或
            [0094] (2)上調MSC中免疫抑制因子的表達;和/或
            [0095] (3)增強MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩定性;和/或
            [0096] (4)降低RNA結合蛋白AUFl的表達水平;和/或
            [0097] (5)抑制T細胞的增殖。
            [0098] 在另一優選例中,所述MSC細胞為骨髓來源的MSC細胞、臍帶來源MSC細胞、脂肪 來源MSC細胞、胎盤來源MSC細胞、和/或牙髓來源MSC細胞。
            [0099] 在另一優選例中,所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎;所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導性肝損傷、肝纖維化、肝硬化。
            [0100] 在另一優選例中,所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
            [0101] 本發明的第九方面,提供了一種藥盒,所述藥盒中包括如權利要求3所述的藥物 組合物和說明書,所述說明書中記載該藥物組合物用于:
            [0102] (1)提高間充質干細胞的免疫抑制功能;和/或
            [0103] (2)上調MSC中免疫抑制因子的表達;和/或
            [0104] (3)增強免疫抑制因子的mRNA的穩定性;和/或
            [0105] (4)降低RNA結合蛋白AUFl的表達水平;和/或
            [0106] (5)抑制T細胞的增殖;和/或
            [0107] (6)治療肝炎或肝損傷。
            [0108] 在另一優選例中,所述MSC細胞為骨髓來源的MSC細胞、臍帶來源MSC細胞、脂肪 來源MSC細胞、胎盤來源MSC細胞、和/或牙髓來源MSC細胞。
            [0109]在另一優選例中,所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎;所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導性肝損
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