一種特異結合trb3的多肽在治療或預防腹主動脈瘤中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種多肽及其衍生物在制備治療或預防腹主動脈瘤的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 腹主動脈瘤指腹主動脈出現向側面和前后搏動的膨脹性腫塊，呈瘤樣擴張，通常 主動脈直徑增大50%以上可定義為動脈瘤。該疾病病變部位具有極高破裂風險，瘤體一旦 破裂，常伴有休克表現，死亡率高達78% -92%，嚴重威脅人類健康。瘤體未破裂時，患者常 伴有臍周及中上腹部劇烈疼痛癥狀，并發動脈粥樣硬化、糖尿病、下肢動脈栓塞、腎積水等 疾病，嚴重影響患者生活質量。腹主動脈瘤常見于老年男性，男女發病之比為10:3。目前 尚針對腹主動脈瘤的治療策略十分有限，大多數患者接受高風險和高成本的手術治療。
[0003] 大量研究指出，腹主動脈瘤病理的發生發展與炎癥因子白介素6、白介素8與氧 化應激堆積密切相關。自噬為機體病變的一種重要防御機制，經典的自噬被定義為通過溶 酶體途徑清除細胞內冗余、錯誤折疊蛋白以及損傷細胞器，防止氧自由基堆積與炎癥。P62 是自噬過程中重要的"貨車蛋白"。P62蛋白結構域中含有泛素相關結構域（Ubiquitin associated domain, UBA)，與泛素化蛋白（(Ubiquitin，Ub)結合，作為"貨車"將受損細胞 器或蛋白募集于自噬小體膜上的LC3,這個過程主要通過P62蛋白的LIR(LC3-Interacting Region, LIR)結構域實現，介導泛素化蛋白的降解，同時，P62的表達水平也隨之降低。當自 噬受到抑制或自噬流被阻斷時，P62與其結合的泛素化蛋白不能及時降解，在胞漿內堆積而 表達升高。胞漿內P62可與氧化應激形成惡性循環，造成細胞毒性，促進炎癥發生發展。
[0004] TRB3 (Tribbles Homologue3)是Tribbles同源蛋白家族成員之一，最早在果蠅中 被鑒定到，并發現該蛋白能抑制有絲分裂，調節發育過程中細胞的增殖、遷移及形態形成。 在哺乳動物中，有三種Tribbles同源蛋白：TRBl，TRB2和TRB3,它們都是假激酶蛋白家族成 員。這三種蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶樣結構域（Kinase like domain, KD)，但卻缺乏ATP 的結合位點和催化殘基，因此沒有激酶活性。盡管如此，Tribbles蛋白卻具有接頭蛋白樣 的功能，參與多種蛋白復合體的組裝。在哺乳動物Tribbles家族成員中，TRB3的研究最為 深入，其相互作用蛋白包括轉錄因子、泛素連接酶、細胞膜上II型BMP受體以及MAPK、PI3K 信號通路成員。通過與這些蛋白相互作用，TRB3參與了糖脂代謝、脂肪細胞分化、凋亡、應 激和膠原表達等的調控。近來多種證據表明，TRB3在腹主動脈瘤相關疾病動脈粥樣硬化的 發生發展過程中都具有重要的調節作用，提示TRB3可能是治療腹主動脈瘤及其相關性疾 病的潛在靶點。
[0005] 有研究指出，TRB3與自噬底物p62相互結合，阻斷自噬。因此，研究和開發TRB3蛋 白的抑制劑，或者阻斷其與P62蛋白結合的物質，具有很好的恢復自噬流，治療腹主動脈瘤 及其相關性疾病發生和發展的成藥前景
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是針對目前缺乏能有效利用的TRB3蛋白抑制劑的現 狀，而提供一種能特異性結合TRB3的多肽及其在制備治療或預防腹主動脈瘤類藥物中的 應用。
[0007] 本發明的發明人在研究的過程中發現，在腹主動脈瘤病變部位以及血管緊張素II 刺激的主動脈平滑肌細胞中，發現自噬經典指標LC3I向LC3II轉化，表明自噬上游信號的 激活。發明人還進一步發現TRB3的表達量升高，與p62發生相互作用，阻斷了自噬流，造成 腹主動脈瘤病變部位蛋白、炎癥因子與氧化應激的堆積。基于發明人的研究工作，本發明提 供下述技術方案。
[0008] 本發明提供的技術方案是：一種可特異性結合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物 在制備治療或預防腹主動脈瘤的藥物中的應用；
[0009] 所述的多肽的氨基酸序列為如SEQ ID NO : 1所示序列；
[0010] 所述多肽的衍生物為所述多肽與細胞穿膜肽接連所形成的嵌合肽。
[0011] 本發明中，所述的如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中，可適當引入氨基酸替換， 缺失或添加，只要改變后的氨基酸序列仍然能夠形成能與TRB3特異性結合的多肽且該多 肽仍然保持改變前的活性即可。
[0012] 本發明中，所述的細胞穿膜肽為本領域常規所述的細胞穿膜肽，只要其能輔助將 所述多肽送入細胞以發揮作用即可，一般而言，所述的細胞穿膜肽為由10~30個氨基酸 組成的短肽分子。所述的細胞穿膜肽較佳地為P印2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 示；即在本發明中，所述的多肽衍生物較佳地為以P印2多肽連接如SEQ ID NO :1所示序列 中的嵌合多肽。所述的細胞穿膜肽還可以為HIV-I病毒反轉錄激活因子（Trans-activator transcription，Tat)蛋白的 TAT 肽（YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如 SEQ ID :3 所示）、果 蠅觸角同源異型蛋白的轉錄因子Antp肽（RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如SEQ ID : 4所示）、P印-1肽（KETWWETWffTEWSQPKKKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID :5所示）、MPG肽 (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸序列如 SEQ ID :6 所示）和 R⑶肽（Arg-Gly-Asp， 其氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示）中的任一種或多種。所述細胞穿膜肽較佳地連接在所 述多肽的N端或者C端，更佳的是N端。
[0013] 本發明所述的多肽及其衍生物可以作為活性成分用于制備預防或治療腹主動脈 瘤的藥物。所述的"活性成分"是指具有預防或治療腹主動脈瘤功能的化合物，即所述多肽 或所述多肽的衍生物用于制備預防或治療腹主動脈瘤的藥物。在該藥物中，所述多肽或所 述多肽的衍生物可以單獨作為活性成分，也可以和其他化合物一起作為活性成分。
[0014] 本發明中，所述的藥物可以包含生理學或藥學上可接受的載體，所述的載體可以 為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料，較佳地選自殼聚糖及其衍生物、卡波姆 和脂質體中的一種或多種。因此，在本發明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物較佳地與所 述藥物輔料組成藥物組合物。所述的藥物組合物可以為本領域常規所述的各種劑型，較佳 地是固體、半固體或液體的形式，可以是水溶液、非水溶液或混懸液，更佳地是片劑、膠囊、 顆粒劑、注射劑或輸注劑等。所述藥物組合物的給藥途徑較佳地為注射給藥或口服給藥，所 述注射給藥較佳地包括：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射途徑給藥。 [0015] 本發明所述的藥物組合物在治療時的使用劑量根據患者的年齡和病情而定，使用 劑量較佳地為〇. 1~15mg/kg，更佳地為5~10mg/kg，最優選為5mg/kg，給藥次數較佳地為 一天一次或數次。
[0016] 本發明中，所述的腹主動脈瘤為本領域常規所指的病理狀態，包括：（1)腹主動脈 直徑增大，呈瘤樣，（2)炎癥因子白介素6高度表達，3)炎癥因子白介素8高度表達，（4)氧 化應激堆積，（5)細胞凋亡指標cleaved caspase3高度表達。
[0017] 在符合本領域常識的基礎上，上述的各優選條件可任意組合，即得本發明各較佳 實例。
[0018] 本發明所用試劑和原料除特別說明之外，均市售可得。
[0019] 本發明的積極進步效果在于：本發明的多肽或多肽衍生物能夠特異性地與TRB3 結合，從而阻斷TRB3與P62蛋白的相互作用，恢復自噬流，該肽段的衍生物P印2-A2可以治 療血管緊張素II誘導的ApoE敲除小鼠腹主動脈瘤，具有非常顯著的療效。
【附圖說明】
[0020] 圖1為用表面等離子共振方法驗證多肽A2與蛋白TRB3的動力學結合曲線。其中 右圖為A2和TRB3的結合曲線。
[0021] 圖2為用酶聯免疫吸附法（ELISA)驗證多肽A2與蛋白TRB3的結合直方圖。中陽 性對照為P62蛋白，陰性對照為牛血清白蛋白BSA。
[0022] 圖3為用競爭酶聯免疫吸附法（ELISA)驗證多肽A2競爭TRB3和P62蛋白結合的 直方圖。其中對照為TRB3與P62的結合直方圖，A2代表加入多肽A2后TRB3與P62的結 合直方圖。
[0023] 圖4為用免疫共沉淀的方法驗證在細胞水平多肽A2的衍生物P印2-A2對蛋白 TRB3和P62相互作用的影響。
[0024] 圖5為用H&E染色方法證明相比于瘤旁對照，腹