一種真皮替代物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫學材料領域，尤其是涉及一種以絲蛋白為主要基質，羧乙基殼 聚糖為次要基質的真皮替代物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 燒創傷等開放性傷口所造成的皮膚缺損是臨床常見病和多發病，在皮膚缺損修復 過程中，傷口過度愈合會導致病理性瘢痕的發生和發展。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢 痕疙瘩，常伴隨瘙癢、毀容、殘疾等一系列嚴重的并發癥，有時甚至誘發惡性腫瘤，嚴重降低 患者的生存質量。因此，病理性瘢痕的防治一直是燒傷、整形等外科學領域中亟待解決的醫 學難題。
[0003] 近年來，隨著創面愈合機制研究的不斷深入，人們發現，瘢痕形成與真皮組織缺失 程度具有高度相關性，這一理論在臨床實踐中也得到了佐證，如淺度燒傷創面在愈合后與 正常皮膚類似，而深度燒傷創面在愈合后將形成病理性瘢痕。這一理論提示：真皮組織的存 在能夠抑制瘢痕的發生和發展。因此，發揮真皮組織作用的真皮替代物材料已在臨床用于 促進深度皮膚缺損創面愈合和抑制瘢痕形成。然而，已有真皮替代物材料雖然取得了一定 的效果，但是仍然未達到抑制病理性瘢痕發生和發展的目標。目前，已上市真皮替代物產品 可分為兩類：脫細胞真皮基質和體外合成高分子支架。脫細胞真皮基質是由人尸體皮、豬 皮、豬小腸粘膜下層經脫細胞處理所得到的成分異質的高分子支架材料，其主要成分為膠 原蛋白；體外合成高分子支架是由合成高分子（如polyglactin)或動物源天然高分子（如 膠原蛋白和/或糖胺聚糖）等體外合成的高分子支架。
[0004] 在臨床應用過程中，已有真皮替代物仍然存在不足之處。首先，由于加工工藝難以 控制，脫細胞真皮基質類真皮替代物的質量不穩定，各生產批次之間可能存在質量差別，進 而影響其作為真皮替代物修復創面的應用效果，并可能造成二次手術等嚴重后果；其次，脫 細胞真皮基質真皮替代物存在生物污染的可能性，由于原料人尸體皮可能攜帶病毒，并且 這些病毒在材料加工過程中未被有效滅活，而導致病毒傳播，并且，脫細胞真皮基質屬于異 體材料，存在引發機體炎癥反應和免疫反應的風險；再次，體外合成真皮替代物在創面的降 解速度與組織生成速度不匹配，往往因降解過快而導致其促進傷口修復和抑制瘢痕形成的 作用減弱；另外，現有真皮替代物在抑制瘢痕形成方面的作用效果遠未達到促進功能性類 真皮組織再生的目標，究其原因，真皮替代物在加工過程中結構被破壞和體外合成真皮替 代物未實現對真皮組織的仿生是影響真皮替代物促進真皮組織再生的重要因素。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供一種真皮替代物及其制備方法。本 發明真皮替代物具有抑制瘢痕形成和促進真皮組織再生的功能，該真皮替代物的制備方法 通過水蒸氣蒸發使絲蛋白分子發生物理交聯，操作簡單，節能、無污染。
[0006] 本發明的技術方案如下：
[0007] -種真皮替代物，所述真皮替代物以絲蛋白為主要基質，羧乙基殼聚糖為次要基 質；其中，絲蛋白的質量分數為60%~90%，羧乙基殼聚糖的質量分數為10%~40%。
[0008] 所述真皮替代物的制備方法，包括如下步驟：
[0009] (1)將蠶繭置于Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水潤洗3次，制得蠶絲 素纖維；然后將蠶絲素纖維置于溴化鋰溶液中，37°C條件下溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液； 最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析3天后，得絲蛋白溶液，調節溶液 質量百分濃度為5% ;
[0010] (2)將步驟⑴制得的絲蛋白溶液與質量百分濃度為3%的羧乙基殼聚糖溶液在 37°C條件下按體積比54:10~9:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min， 至混合均勻，然后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0011] (3)將步驟（2)離心后的混合液轉移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風風速為0. 3米/秒的通風櫥中央，放置時間為24h，形成絲蛋白/ 羧乙基殼聚糖高分子膜；
[0012] (4)將絲蛋白/羧乙基殼聚糖高分子膜浸沒于1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合水溶液中，40°C下放置8h ;將所得高分子膜在300ml去離子 水中浸泡30min，此步驟重復3次，最后將所得高分子膜在300ml液氮溶液中冷凍lOmin;
[0013] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度3~5Pa，時間18h，制得絲蛋白/羧乙基殼聚糖復合材料，即所述真皮 替代物。
[0014] 步驟⑴中所述Na2C03水溶液濃度為0. 01~1M;所述溴化鋰溶液的濃度為1~ 20M〇
[0015] 步驟（4)中所述1-(3_二甲氨基丙基）_3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混 合水溶液中1_(3_二甲氨基丙基）_3_乙基碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的濃度比為1:1， 均為0. 02M;所述混合溶液的pH值為4. 5。
[0016] 本發明有益的技術效果在于：
[0017] (1)本發明所用絲蛋白分子能夠發生物理交聯，避免了在構建真皮替代物的過程 中引入化學交聯劑，提高材料的生物相容性；絲蛋白分子結構中約含有85%的甘氨酸、丙 氨酸和絲氨酸的重復嵌段，這些重復嵌段之間會形成氫鍵而使絲蛋白分子內部或絲蛋白分 子之間產生疏水結構，這種疏水結構使絲蛋白分子發生物理交聯，而避免使用化學交聯劑。
[0018] (2)本發明通過水蒸氣蒸發使絲蛋白分子發生物理交聯，能夠提高絲蛋白/羧乙 基殼聚糖復合材料對真皮組織結構和力學性能的仿生性能，降低所制備的絲蛋白/羧乙基 殼聚糖復合材料的硬度，使其在力學性質方面與真皮組織更加接近，有利于提高真皮替代 物抑制瘢痕形成和促進真皮組織再生的功能。；這是由于水蒸氣蒸發過程能夠促進絲蛋白 分子自組裝形成Silk I結構并抑制Silk II結構的產生，而在甲醇水溶液中絲蛋白分子發 生自組裝主要形成Silk II結構，即e-Sheet結構；當絲蛋白分子的物理交聯形式主要為 Silk I時，絲蛋白基支架材料在孔結構和力學性能方面優于以Silk II結構為主的相應材 料。
[0019] (3)本發明羧乙基殼聚糖分子的引入能夠提高真皮成纖維細胞和微血管內皮細胞 在支架中的黏附和增殖活性；羧乙基殼聚糖的分子結構與脫細胞真皮基質中的糖胺聚糖結 構類似，能夠發揮與糖胺聚糖類似的生物學作用，即通過與細胞外基質中的細胞因子、生長 因子等發生相互作用，提高這些蛋白質信號分子的生物利用度，從而提高細胞的生物活性； 因而，在絲蛋白支架中引入羧乙基殼聚糖能夠促進真皮成纖維細胞和微血管內皮細胞的黏 附性和增殖活性。
[0020] (4)本發明采用1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺濃度和N-羥基琥珀酰亞 胺對絲蛋白/羧乙基殼聚糖復合材料進行交聯處理，此化學交聯法能夠將羧乙基殼聚糖分 子固定于絲蛋白交聯網絡中，形成互穿網絡，從而阻礙酶在支架網絡中的擴散和活性，能夠 減慢絲蛋白/羧乙基殼聚糖的生物降解速度
[0021] (5)本發明采用真空冷凍干燥處理獲得絲蛋白/羧乙基殼聚糖基真皮替代物，能 夠材料在干態下保持其多孔結構和力學特性。
[0022] (6)本發明采用絲蛋白作為制備真皮替代物的主要基質，羧乙基殼聚糖為制備真 皮替代物的次要基質，對絲蛋白自組裝過程具有調控作用。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明實施例1所得真皮替代物的掃描電鏡圖。
[0024] 圖2為本發明對比例1所得純絲蛋白膜的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖和實施例，對本發明進行具體描述。
[0026] 實施例1
[0027] -種真皮替代物的制備方法，具體步驟如下：
[0028] (1)將10g蠶繭置于500ml的0? 02M Na2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水 潤洗3次，制得蠶絲素纖維；然后將蠶絲素纖維置于10ml 9. 3M的溴化鋰溶液中，37°C條件 下溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液；最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析 3天后，得絲蛋白水溶液，調節溶液質量百分濃度為5% ;
[0029] (2)將步驟⑴制得的絲蛋白溶液與質量百分濃度為3%的羧乙基殼聚糖溶液在 37°C條件下按體積比30:10混合，在速度為50rpm/min的漩禍振蕩器上振蕩5min，至混合均 勻，然后在離心力為1500g下離心3min，除去溶液中的氣泡；
[0030] (3)將步驟⑵離心后的混合液轉移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度為2mm，然后 將此槽放置于37°C、吸風風速為0. 3米/秒的通風櫥中央，放置時間為24h，形成絲蛋白/ 羧乙基殼聚糖高分子膜；
[0031] (4)將絲蛋白/羧乙基殼聚糖高分子膜浸沒于300ml 1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙 基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合水溶液中（溶質1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳 二亞胺濃度為〇. 02M，溶質N-羥基琥珀酰亞胺濃度為0. 02M，pH = 4. 5)，40°C下放置8h ; 將所得高分子膜在300ml去離子水中浸泡30min，此步驟重復3次，最后將所得高分子膜在 300ml液氮溶液中冷凍lOmin ;
[0032] (5)將冷凍的高分子膜在真空冷凍干燥機中冷凍干燥，真空冷凍干燥條件為：冷 阱溫度_55°C、真空度5Pa，時間18h，制得絲蛋白/羧乙基殼聚糖復合材料，即所述真皮替代 物。其中，絲蛋白的質量分數為64%，羧乙基殼聚糖的質量分數為36%。
[0033] 通過掃描電子顯微鏡觀察實施例1所述真皮替代物的微觀結構，如圖1所示。由 圖1可以看出，由水蒸氣蒸發處理所得的真皮替代物，其內部微觀結構為聯通的多孔結構。
[0034] 實施例2
[0035] -種真皮替代物的制備方法，具體步驟如下：
[0036] (1)將10g蠶繭置于500ml的0? 02MNa2C03水溶液中沸煮30min，然后用去離子水 潤洗3次，制得蠶絲素纖維；然后將蠶絲素纖維置于10ml 9. 3M的溴化鋰溶液中，37°C條件 下溶解，制得絲蛋白溴化鋰溶液；最后將所得溶液在截留分子量為3500Da的透析盒中透析 3天后，得絲蛋白水溶液，調節溶液質量百分濃度為5% ;
[0037] (2)將