從金花茶葉中提取多酚的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物提取技術領域，具體涉及從金花茶葉中提取多酚的方法。
【背景技術】
[0002] 金花茶屬山茶科山茶屬金花茶組植物，金花茶葉中含有多酚、黃酮、皂苷以及天然 有機鍺、硒、錳、釩、鋅等十多種微量元素，具有抗氧化以及抑制腫瘤生長的作用。研究認為， 金花茶葉醇提物和水提物對腫瘤細胞的增殖具有一定的抑制能力，這與金花茶葉中的多酚 與黃酮類物質密切相關。多酚類物質的酚羥基能與自由基結合，從而效清除脂類細胞周圍 的自由基，進而控制自由基引起的脂質過氧化，預防因細胞DNA破壞而致癌。黃酮類物質將 氫供給脂類化合物自由基后自身轉變為酚基自由基從而阻斷了自動氧化鏈反應而起到了 抗氧化作用，進而控制自由基引起的脂質過氧化，預防因細胞DNA破壞而致癌。《金花茶對二 乙基亞硝胺致大鼠肝癌抑制作用研究》（醫學研究雜志，2006, 35(6) :14-16))通過建立DEN 誘導的肝癌前病變模型，發現在飼料中添加5%的金花茶葉及其濃縮液具有明顯抑制肝癌 前病變的作用，金花茶葉以及濃縮液對肝癌病灶個數的抑制率分別為46. 46%和67. 24%， 對肝癌病灶總面積的抑制率分別為53. 42%、67. 34%。該文獻進一步認為茶多酚公認具有 抗癌作用，金花茶所表現出的抑制肝癌作用可能與茶多酚有關，不過，兩者的相關性還有待 證實。此外，金花茶中所含的微量元素，也可能對抑制肝癌作用有一定貢獻。從活性成分的 角度看，金花茶中存在某些活性的天然產物類別如二萜類、三萜類、黃酮類、生物堿等，金花 茶具有的抗肝癌作用則可能是這些潛在活性成分的宏觀表現。鑒于目前金花茶葉活性成分 以及藥理作用機制尚不明確，因此，有必要對金花茶葉進行更深入研究，有助于研發出抗肝 癌作用更強的藥物。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種從金花茶葉中提取多酚的方法，提取得到的 多酚類物質對肝癌細胞的生長具有極強的抑制作用。
[0004] 本發明提供的技術方案是從金花茶葉中提取多酚的方法，其特征在于：包括以下 步驟：
[0005] 1)將金花茶葉粉碎，加入50~70v%乙醇回流提取1~3次，每次提取1~3h，合 并提取液，過濾，取濾液備用；
[0006] 2)將濾液過截留分子量為3000的中空纖維膜，得到第一次濃縮液和第一次透過 液；將第一次濃縮液過截留分子量為1萬的中空纖維膜，得到第二次透過液和第二次濃縮 液，并將第二次濃縮液過截留分子量為8萬，得到第三次透過液；
[0007] 3)將第一次透過液上弱極性大孔吸附樹脂柱，先水洗柱至無色，再用45~55%乙 醇洗脫，薄層層析跟蹤檢測，收集含目標成分的乙醇洗脫液；
[0008] 4)將第三次透過液上非極性大孔吸附樹脂柱，先水洗柱至無色，再用65~75%乙 醇洗脫，薄層層析跟蹤檢測，收集含目標成分的乙醇洗脫液；
[0009] 5)將步驟3)和步驟4)所述的洗脫液混合，濃縮，干燥，即得多酚類物質。
[0010] 步驟2)中，將濾液先后過截留分子量為3000、1萬和8萬的中空纖維膜，第一次透 過液為分子量小于3000的物質，其中包括多酸、黃酮、小分子多肽、氨基酸、小分子糖、色素 以及礦物質；而第三次透過液為分子量大于1萬且小于8萬的大分子物質，其中包括蛋白 質、多糖、大分子黃酮苷等。
[0011] 步驟3)中，選用弱極性大孔吸附樹脂可充分吸附第一次透過液中的多酚類物質 弱極性以及非極性物質，氨基酸、糖類則不僅吸附而直接流出，吸附分離效果好。弱極性大 孔吸附樹脂以XDA-5或XDA-200為優，XDA-5樹脂平均孔徑為30A°，比表面積為500m 2/g， XDA-200樹脂平均孔徑為20A°，比表面積為20A°，上述兩種樹脂不僅為弱極性樹脂，且平 均孔徑較小，剛好吸附透過液中的多酚類物質活性成分，大分子物質無法進入樹脂孔，而更 小分子量的氨基酸、單糖、多糖以及礦物質則因為通過樹脂孔速度比多酚類物質快而不被 吸附，因此，吸附分離效果大大提高。
[0012] 步驟4)中，第三次透過液中的目標成分為黃酮苷類大分子物質（也屬于多酚類物 質），由于黃酮與糖苷結合后極性大大減弱，基本上為非極性物質，因此，采用非極性樹脂將 其吸附分離效果較好。所述非極性大孔吸附樹脂以XAD1600或XAD16為優，其中XAD1600平 均孔徑為150A。，比表面積為800m 2/g，XAD16平均孔徑為150A。，比表面積為800m2/g，上 述兩種樹脂不僅為非極性樹脂，且平均孔徑與黃酮苷類物質相匹配，剛好吸附透過液中的 黃酮苷類物質，比其分子量大的蛋白質、多糖則無法進入樹脂孔，而比其分子量小的多肽， 多糖則由于通過樹脂孔速度快而不被吸附，因此吸附分離效果好。
[0013] 步驟5)中，將干燥的多酸類物質粉末，經F-C(Folin_Ciocalteu比色法）檢測，多 酚含量為96%以上。
[0014] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0015] 1)本發明通過提取分子量小于3000以及1~8萬兩個區間內的多酚類物質，驚人 地發現上述分子量區間內的多酚類物質對肝癌細胞的生長抑制效果極其顯著，遠遠超出現 有技術水平。
[0016] 2)本發明的多酚類物質不僅防癌效果好，且用量極低，僅為常規用量的1/20。
【具體實施方式】
[0017] 以下具體實施例對本發明作進一步闡述，但不作為對本發明的限定。
[0018] 實施例1
[0019] 1)將金花茶葉100g，粉碎至30目，加入2000ml 50v %乙醇回流提取lh，將提取液 過濾，取濾液備用；
[0020] 2)將濾液過截留分子量為3000的中空纖維膜，得到第一次濃縮液和第一次透過 液；將第一次濃縮液過截留分子量為1萬的中空纖維膜，得到第二次透過液和第二次濃縮 液，并將第二次濃縮液過截留分子量為8萬，得到第三次透過液；
[0021] 3)將第一次透過液上XDA-5大孔吸附樹脂柱，先水洗柱至無色，再用45%乙醇洗 脫，薄層層析跟蹤檢測，收集含目標成分的乙醇洗脫液；
[0022] 4)將第三次透過液上XAD1600大孔吸附樹脂柱，先水洗柱至無色，再用65%乙醇 洗脫，薄層層析跟蹤檢測，收集含目標成分的乙醇洗脫液；
[0023] 5)將步驟3)和步驟4)所述的洗脫液混合，濃縮，干燥，即得1.86g多酚類物質，經 F-C法檢測浸膏中多酚含量為96. 6 %。
[0024] 對照例1
[0025] 1)將金花茶葉100g，粉碎至30目，加入2000ml 50v %乙醇回流提取lh，將提取液 過濾，取濾液備用；
[0026] 2)將濾液上XDA-5大孔樹脂柱，先水洗柱至無色，再用45%乙醇洗脫，薄層層析跟 蹤檢測，收集含目標成分的乙醇洗脫液；
[0027] 3)將乙醇洗脫液濃縮，干燥，即得多酚類物質。
[0028] 實施例2
[0029] 1)將金花茶葉100g，粉碎至30目，加入3000ml70v%乙醇回流提取3次，每次提 取3h，合并提取液，過濾，取濾液備用；
[0030] 2)將濾液過截留分子量為3000的中空纖維膜，得到第一次濃縮液和第一次透過 液；將第一次濃縮液過截留分子量為1萬的中空纖維膜，得到第二次透過液和