大孔吸附樹脂分離純化辣蓼黃酮的工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中草藥辣寥總黃酮的分離純化技術，尤其涉及一種大孔吸附樹脂分離 純化辣寥黃酮的工藝。
【背景技術】
[0002] 辣寥（Polygonum hydropiper Linn.)在我國分布廣泛，資源豐富，主要成分為革柔 質、黃酮和揮發油，其中黃酮類化合物有：蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山萘酚、異鼠李素。近年 來國內外學者發現黃酮類化合物具有良好的抗菌、抗病毒、抗氧化活性，除此之外，還能降 血壓、降血脂，并能提高機體免疫力。
[0003] 近年來，大孔吸附樹脂被廣泛運用于中草藥有效成分的分離及新藥的開發與研 制，是一類有機高分子聚合物吸附劑，其具有價格便宜，穩定性高、吸附快，吸附容量大，洗 脫率高，解吸條件溫和，再生簡便，使用周期長等優點。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種工藝簡單方便、分離純化效果好、再生使用 周期長的大孔吸附樹脂分離純化辣寥黃酮的工藝。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：大孔吸附樹脂分離純化辣寥黃 酮的工藝，包括以下步驟：
[0006] (1)利用超聲-酶解偶聯法對辣寥藥材進行總黃酮的提取；
[0007] (2)將步驟（1)獲得的提取液依次經過石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取， 收集乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黃酮，減壓蒸干備用；
[0008] (3)將步驟（2)獲得的乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黃酮配制成濃度為0. 5~ 1. 5mg/mL的上柱液，通過預處理好的大孔吸附樹脂，用60~80%乙醇洗脫4~10倍量柱 體積，洗脫液進行蒸發濃縮，真空干燥，即得純化辣寥總黃酮。
[0009] 預處理按以下操作進行：取大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24h充分溶脹之后裝 柱，用95%乙醇沖洗，收集洗脫液，檢查洗脫液無渾濁即可停止收集洗脫液（方法為加入等 體積的去離子水后無渾濁），然后用去離子水洗脫，除去乙醇，；用4倍量柱體積的3%鹽酸 溶液沖洗，去離子水沖洗至中性；用4倍量柱體積的3%氫氧化鈉溶液沖洗，去離子水沖洗 至中性即可。
[0010] 大孔吸附樹脂為弱極性或極性的大孔吸附樹脂。
[0011] 大孔吸附樹脂為D101、AB-8、DM-130或XDA-8型號。
[0012] 步驟⑴按以下操作進行：
[0013] (1)將辣寥藥材干燥、粉碎，分別加入重量為辣寥藥材重量0. 2~0. 4%的果膠酶 和纖維素酶，混合均勻，加入pH值為4. 8的HAc-NaAc緩沖液，進行超聲-酶解；
[0014] (2)用.0)3溶液調節超聲-酶解后的溶液pH值為9. 0,80~90°C水浴10~ 20min使酶失活；
[0015] (3)加入乙醇浸提24h，過濾收集浸提液，濾渣再加入乙醇溶液重復浸提一次，過 濾，合并兩次浸提液。
[0016] 超聲-酶解溫度為30~60°C，時間為1. 0~2. Oh。
[0017] HAc-NaAc緩沖液與辣寥藥材的體積質量比為5~50mL : lg。
[0018] 步驟（3)中加入乙醇后，乙醇的終體積濃度為60~80%。
[0019] 為提高有效辣寥黃酮有效成分的含量，發明人建立了一種大孔吸附樹脂分離純化 辣寥黃酮的工藝，該法以超聲-酶解偶聯法提取的辣寥總黃酮提取液為原料，經多種有機 溶劑萃取后，將乙酸乙酯部分和正丁醇部分的黃酮利用大孔吸附樹脂進一步分離純化，獲 得了純化辣寥總黃酮。試驗表明，本發明的工藝具有成本較低、穩定性高、吸附快、吸附容量 大、洗脫率高、解吸條件溫和、再生簡便和使用周期長等優點，是一種理想的辣寥總黃酮分 離提純工藝。
【附圖說明】
[0020] 圖1是四種大孔吸附樹脂對辣寥乙酸乙酯部分黃酮的靜態吸附動力學曲線。
[0021] 圖2是四種大孔吸附樹脂對辣寥正丁醇部分黃酮的靜態吸附動力學曲線。
[0022] 圖3是上樣液濃度對XDA-8大孔吸附樹脂辣寥黃酮吸附量的影響。
[0023] 圖4是上樣液pH值對XDA-8大孔吸附樹脂辣寥黃酮吸附量的影響。
[0024] 圖5是XDA-8大孔吸附樹脂動態累積泄露曲線。
[0025] 圖6是總黃酮洗脫曲線。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1辣寥總黃酮的提取
[0027] (1)利用超聲-酶解偶聯法對辣寥藥材進行總黃酮的提取；
[0028] 將辣寥原藥粉至100目，按料液比為1 : 30與pH 4. 8的Hac-NaAc緩沖液混合，加 入0. 25%的纖維素酶與果膠酶在50攝氏度下超聲1. 5h，之后用Na2C03溶液調pH至9. 0， 在85°C下水浴15min使酶滅活。加入純乙醇使酶解液中醇濃度為60%，浸提24h，回收浸提 液，濾渣按1 : 30的料液比再加入60%乙醇溶液重復浸提一次，過濾，合并兩次的濾液，濾 液經過石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。收集乙酸乙酯與部分與正丁醇部分，減壓 蒸干備用。
[0029] 實施例2大孔吸附樹脂對辣寥黃酮的吸附試驗
[0030] 大孔吸附樹脂的預處理--取各型大孔吸附樹脂（D101、AB-8、DM-130和XDA-8型 號）分別用無水乙醇浸泡24h充分溶脹之后裝柱，用95%乙醇沖洗，收集洗脫液，檢查洗脫 液無渾濁即可停止收集洗脫液（方法為加入等體積的去離子水后無渾濁），然后用去離子 水洗脫，除去乙醇；用4倍量柱體積的3%鹽酸溶液沖洗，去離子水沖洗至中性；用4倍量柱 體積的3%氫氧化鈉溶液沖洗，去離子水沖洗至中性。
[0031] 靜態吸附試驗一一將辣寥乙酸乙酯部分黃酮或正丁醇部分黃酮配制成黃酮濃度 為0. 75mg/mL的待上樣溶液。將預處理好的大孔吸附樹脂抽濾至不滴水，各精密稱取2. 0g 放置于100mL具塞錐形瓶中，分別準確加入50mL辣寥乙酸乙酯部分黃酮或正丁醇部分黃 酮，于室溫下以120r. min 1的速度在搖床中振搖24h充分吸附后，取上清液用0. 22 y m濾膜 過濾，濾液用分光光度計測定剩余黃酮含量，分別計算各大孔吸附樹脂的靜態吸附量，結果 見表1。
[0032] 靜態解吸試驗一一取上述方法中已吸附飽和的樹脂，分別加入50mL 95%的乙醇 溶液。在室溫下以120r.mii!1的速度在搖床中振搖24h，使大孔吸附樹脂解吸完全，取上清 液用0. 22 ym濾膜過濾，濾液用分光光度計測定其中蘆丁和黃酮含量的含量，分別計算各 大孔吸附樹脂的靜態解吸量，結果見表2。
[0033] 靜態解吸率的計算將由靜態解吸量和靜態吸附量之比求得，公式如下：
[0034] 靜態吸附量（mg/g) = V藥液X (C。、) /M樹脂
[0035] 靜態解吸量（mg/g) = V洗脫液X C2/M樹脂
[0036] 解吸率％ =靜態解析量/靜態吸附量X 100%
[0037] 其中，C。為黃酮初始濃度（mg/mL)，C :為黃酮剩余濃度（mg/mL)，C 2為洗脫液中黃 酮濃度（mg/mL)，M樹脂為樹脂質量（g)。
[0038] 大孔吸附樹脂的靜態吸附動力學特性測定一一將辣寥乙酸乙酯部分黃酮與正丁 醇部分黃酮配制成黃酮濃度為〇. 75mg/mL的待上樣溶液。準確移取辣寥乙酸乙酯部分黃 酮與正丁醇部分黃酮50mL，分別加入盛有4種大孔樹脂的錐形瓶內，置恒溫振蕩器上振蕩， 30°C，120r/min，每隔一段時間取lmL溶液測定，連續測定8h，計算樹脂對辣寥乙酸乙酯部 分黃酮與正丁醇部分黃酮的吸附率，確定吸附容率與時間的關系，繪制吸附動力學曲線，研 究其吸附速率，結果見圖1、圖2。
[0039] 表1四種大孔吸附樹脂對辣寥黃酮靜態吸附量
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[0043] 表3四種大孔吸附樹脂對辣寥黃酮靜態解吸率
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