一種骨缺損再生修復組織工程骨及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于組織工程與再生醫學醫用生物材料技術領域，具體涉及一種具有生理性再生生物活性組織工程骨及其構建方法。該組織工程骨可用于骨缺損的再生修復。
【背景技術】
[0002]在目前的骨科治療領域中，對各種創傷、感染、腫瘤切除以及某些先天性發育畸形等導致的四肢骨缺損、顱蓋骨缺損仍然是骨科臨床最常見、最棘手的一大難題。骨缺損的治療方法主要包括骨移植、骨延長術、組織工程技術等。
[0003]組織工程骨的構建越來越多的被開發，其優勢也越來越凸顯，但不同的構建策略的效果存在很大的差異。其中，通過組織工程技術構建的骨移植材料通常包含一個或多個功能成分，即包括具有骨傳導的基質材料，基質材料為新骨生長提供支架；具有骨誘導性的生物分子或化學藥物形成具有再生潛能的微環境，誘導構建及修復過程中種子細胞分化為成骨細胞；篩選合適的種子細胞，在適當環境下快速生成新的骨組織。
[0004]( I)骨移植基質材料
天然骨材料加工處理的骨支架材料主要包括:①自體骨，其主要優點在于兼具骨傳導性、骨誘導性和成骨作用；缺點主要體現在取骨區并發癥(取骨區疼痛及其他潛在的切口感染、血腫、骨折等)、取骨量有限、出血量增加及手術時間延長等方面。②異體骨，異體骨移植物可提供骨傳導支架，并保留大部分骨誘導蛋白成分，兼具骨傳導及骨誘導能力，但免疫排異反應可使移植骨中供體來源的細胞被殺死，故缺乏成骨能力。此外，異體骨移植物應用的安全性一直備受關注，疾病傳播仍是異體骨移植物應用的最大風險之一。③去礦物質骨基質(demineralized bone matrix，DBM)，又稱為脫|丐骨基質，是由異體或自體骨組織經過不同的脫礦物工序處理后獲得的骨移植材料，不僅能填充骨缺損，也有潛在的骨傳導及骨誘導作用。DBM能促進血管再生，并誘導宿主干細胞分化為成骨細胞。據推測，DBM的生物活性與脫礦物處理后殘存的基質蛋白及生長因子有關。
[0005](2)骨再生微環境
再生微環境主要是由生長因子形成的，在骨再生過程中發揮重要作用。生長因子是由特定細胞產生，在不同生理過程中發揮效用的一些多肽，其在骨組織修復過程中起著重要調控作用。胰島素樣生長因子(IGF-1)和轉化生長因子(TGF-B)主要調節軟骨基質合成。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)則為強力有絲分裂因子，能促進軟骨細胞分化。血小板衍生生長因子(TOGF)和血管內皮生長因子(VEGF)表現出促進骨折愈合的作用。人骨形態發生蛋白(rhBMP-2)和磷酸三鈣復合物在骨缺損修復中較單純磷酸三鈣為佳。
[0006]為了獲得滿意效果，上述生物分子需要載體送至所需部位并在適當時候釋放，還需要一些輔助因子以最大程度地發揮效用。這些要求在很大程度上限制了生長因子的臨床使用，同時亦需要更多研究證明生長因子的臨床功效、可靠性及安全性。
[0007](3)種子細胞合適的種子細胞是生理性骨再生的重要基礎。干細胞作為組織工程構建的種子細胞具有多向分化潛能、更新能力快、幾乎無免疫原性等諸多優點，在骨組織工程中發揮重要作用。對于組織工程骨移植，最好的選擇是能分化為骨和軟骨等組織的間充質干細胞。
[0008]理想的骨修復再生移植材料支架應該具備良好的生物相容性、骨整合能力，可形成骨再生微環境以促進內源和外源種子細胞的骨再生，修復后能與宿主骨完美融合。還有，理想的骨修復再生移植材料支架還需滿足生理學功能和力學功能達到自然狀態水平，實現生理再生、價格低廉、容易制造等要求。人們對骨移植材料的研究集中于以下幾個方面:①改善基質材料的生物力學性能和生物相容性，使骨移植材料具備與骨形成速度相匹配的降解速率；②增強基質材料與生物活性物質的親和力，并使其釋放過程可控；③生物活性物質的選擇與獲取，以及各物質間的最佳搭配等。總之，將生物活性物質與理想的基質材料組合構建復合骨移植材料，在結構仿生化、骨整合能力最優化和降解與再生同步化等方面獲得更大進步，是未來骨移植材料的發展方向。
[0009]現有骨修復移植材料及其在骨缺損修復上的應用，都屬于非生理性再生。其整體表現出材料不能或不宜降解、生物相容性差，導致修復后幾乎沒有延展性、導熱能力差，修復后與原來骨結合不完整、形狀、大小、厚度均與自體骨有差異等諸多缺陷。從骨再生生理過程來看，采用單純的骨材料、材料與因子復合、材料復合細胞技術形成骨的能力以及對骨缺損修復效果還不理想。因此，組織工程骨的構建仍需要從以下方面做出進一步的提升:修復重建過程快速與周圍骨融合；同時生物因子及干細胞分泌的因子促進自體修復參與細胞的生物學行為；快速參與修復實現生理性骨再生；修復后的骨具有良好的力學性能、生物學性能、結構穩定性(與天然骨一致，可形成骨縫)；與周邊自體骨結合完整厚度一致。
【發明內容】
[0010]本發明的目的在于構建了一種骨缺損再生修復組織工程骨，其可用于骨缺損的生理性再生修復。本發明可以實現骨的生理再生并提高骨缺損的修復治療效果。
[0011]為達到上述的目的，本發明采取如下的技術方案:
本發明構建了一種骨缺損再生修復組織工程骨，是由三層骨髓間充質干細胞聚合體與兩層骨基質顆粒構成的復合層狀結構體，其中，骨基質顆粒作為再生支架，骨髓間充質干細胞聚合體黏附包裹再生支架。需要強調的是，骨髓間充質干細胞聚合體是由骨髓間充質干細胞快速增值形成的，并含有由骨髓間充質干細胞分泌的大量的胞外基質，胞外基質中含有促使新骨生成的活性因子。
[0012]所述復合層狀結構體是由三層骨髓間充質干細胞聚合體包裹兩層骨基質顆粒形成的骨缺損再生修復產品，是采用“骨髓間充質干細胞聚合體--骨基質顆粒--骨髓間充質干細胞聚合體--骨基質顆粒--骨髓間充質干細胞聚合體”的復合模式制備的修復產品。具體而言，所述復合層狀結構體由下至上依次為平鋪于底層的骨髓間充質干細胞聚合體，均勻平鋪于底層骨髓間充質干細胞聚合體上的骨基質顆粒，在骨基質顆粒上平鋪位于中間層的骨髓間充質干細胞聚合體，均勻平鋪于中間層骨髓間充質干細胞聚合體上的骨基質顆粒，以及平鋪于骨基質顆粒上的位于上層的骨髓間充質干細胞聚合體。
[0013]進一步地，所述骨髓間充質干細胞聚合體包括骨髓間充質干細胞以及由骨髓間充質干細胞分泌的并分布在骨髓間充質干細胞周圍的胞外基質。骨髓間充質干細胞分泌的大量的胞外基質形成骨再生骨微環境，可以誘導內源和外源種子細胞參與骨重建。這里的種子細胞是指本發明所述的骨髓間充質干細胞。
[0014]為了與骨缺損的厚度相匹配，同時創造利于骨髓間充質干細胞參與骨重建的微環境，所述復合層狀結構體的每層骨髓間充質干細胞聚合體均優選為兩張骨髓間充質干細胞聚合體，每張骨髓間充質干細胞聚合體具有6?10層骨髓間充質干細胞層。在構建骨髓間充質干細胞細胞聚合體的過程中，胞外基質與骨髓間充質干細胞均勻分布和排列形成6?10層細胞膜片樣聚合體，其厚度達到75?150 μ m。
[0015]如上所述骨基質顆粒作為組織工程骨的再生支架，優選地，所述所述骨基質顆粒是選用自體骨制備的骨基質顆粒，移植后無抗原排斥反應。進一步地，自體骨或脫鈣骨基質顆粒的粒徑為0.2?0.5cm。將自體骨或脫鈣骨基質處理為直徑0.2?0.5cm的微粒，有利于形成骨再生支架的合理空間。
[0016]另一方面，本發明還提供了所述骨缺損再生修復組織工程骨的構建方法，包括骨髓間充質干細胞分離培養、骨髓間充質干細胞聚合體的構建、骨基質顆粒制備和組織工程骨的構建等步驟。具體而言，包括如下步驟:
步驟一:骨髓間充質干細胞分離培養
過濾骨髓血樣本，用培養液I調整骨髓間充質干細胞濃度為5.0X 15?1.0X 10 6個/mL，并接種于培養瓶中，靜置12?18h，待骨髓間充質干細胞貼壁后將培養基I更換為培養液II ；
在37±1°C、4.5?5.5%C02、濕度飽和條件下培養48?72h，棄培養液II，用0.lmol/LPBS洗滌兩遍并更換新的培養基II，以后每72?96h更換培養液II I次，待細胞融合率達到70%?85%時，進行傳代擴大培養至P3代細胞。
[0017]步驟二:骨髓間充質干細胞聚合體的構建
將P3代骨髓間充質干細胞，用培養液III配制成細胞濃度為5.0 X 15?1.0X10 7個/mL的骨髓間充質干細胞懸液，取2mL?8mL骨髓間充質干細胞懸液接種于直徑為3cm?1cm培養皿中，靜置于37±1°C、4.5?5.5%C0J?箱中培養；每隔22?26小時更換培養液III一次，培養7?10天至骨髓間充質干細胞聚合體形成，將培養液III更換為培養液IV，繼續培養3天；用生理鹽水清洗骨髓間充質干細胞聚合體，從培養皿中取出骨髓間充質干細胞聚合體并用生理鹽水漂洗3次，備