鏈接粘附分子jam-a促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉基因工程技術(shù)及生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及鏈接粘附分子JAM-A在促 進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)中的新用途，也即一種促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的方法，及其鏈接粘附分子JAM-A 在制備皮膚創(chuàng)面修復(fù)藥物或試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚是人體面積最大的器官，也是機(jī)體自我更新速度最快的組織之一，它是機(jī)體 免于脫水、損傷、感染的第一道防線，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和阻止微生物、化學(xué)物質(zhì)等侵入的 屏障。盡早覆蓋創(chuàng)面，恢復(fù)皮膚的屏障功能，十分重要。常規(guī)的治療方法采用自體皮膚或同 種異體、異種皮膚的移植和人工替代物覆蓋等，由于存在著供皮來源有限，同種異體、異種 皮移植有免疫排斥反應(yīng)或傳染疾病的危險(xiǎn)，人工皮膚費(fèi)用昂貴等問題，常規(guī)方法難以滿足 臨床應(yīng)用的需要（參加文獻(xiàn) 1 :Meier TO, Guggenheim M, Vetter ST，et al.Microvascular regeneration in meshed skin transplants after severe burns.Burns.2011 ； 37 (6) : 1010-4.)。因此，促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)已成為組織修復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題之一，研究 皮膚創(chuàng)傷愈合修復(fù)具有重要的理論和實(shí)際意義。
[0003] 鏈接粘附分子JAM-A(NM_016946)是一個(gè)跨膜分子，屬于免疫球蛋白超家族。 JAM-A同源二聚化后可與細(xì)胞內(nèi)的roZ(PSD-95/Discs-large/Z0-l)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，和細(xì)胞迀 移、胞內(nèi)外信號(hào)傳遞、細(xì)胞緊密連接及血管生成關(guān)系密切（參加文獻(xiàn)2:S evers〇n EA，Lee WY, Capaldo CT, Nusrat A, Parkos CA. Junctional adhesion molecule A interacts with Afadin and PDZ_GEF2to activate Rap1A, regulate betalintegrin levels, and enhance cell migration.Molecular Biology of the Cell, 2009V〇1. 20, 1916 - 1925.)。此外， JAM-A在細(xì)胞迀移，器官發(fā)育及上皮細(xì)胞分化等方面也有重要作用（參見文獻(xiàn)3 :Nava P, Capaldo CT, Koch S, et. al. JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/0 -catenin signalling. EMB0 Rep. 2011Apr ;12 (4) : 314-20)有研究者通過細(xì)胞 劃痕試驗(yàn)證明，JAM-A可促進(jìn)上皮細(xì)胞迀移（參見文獻(xiàn)4 :PorfirioNava, Christopher T.Capaldo, Stefan Koch, KeliKolegraff, Carl Robert Rankin, AttilaE. Farkas, Mattie E. Fease, LinhengLi, Caroline Addis,CharlesA.Parkos&AsmaNusrat. JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/b-catenin signalling EMB0 r印orts (2011) 12, 314 - 320)〇
[0004] 目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)JAM-A基因在創(chuàng)面修復(fù)的應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供鏈接粘附分子JAM-A的新用途，具體是在制備皮膚創(chuàng)面修 復(fù)藥物或試劑中的應(yīng)用；本發(fā)明的另一目的在于提供一種促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的方法；本發(fā) 明的第三目的在于提供一種鏈接粘附分子JAM-A基因表達(dá)的載體（pGC-FU-JAM-A-GFP)及 其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明在前期試驗(yàn)中證實(shí)JAM-A上調(diào)后成纖維細(xì)胞的迀移和增殖能力增加，并且 JAM-A修飾后的間充質(zhì)干細(xì)胞較對(duì)照組顯著促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。那么JAM-A能否直接促 進(jìn)創(chuàng)面愈合？
[0007] 為了解答這些困惑，本發(fā)明進(jìn)一步地構(gòu)建了 JAM-A的過表達(dá)和干擾的慢病毒以更 加高效穩(wěn)定地調(diào)整創(chuàng)面組織中JAM-A的表達(dá)，體內(nèi)檢測JAM-A單獨(dú)使用是否能促進(jìn)創(chuàng)面修 復(fù)。
[0008] 本發(fā)明選擇慢病毒進(jìn)行載體構(gòu)建的出發(fā)點(diǎn)是慢病毒的感染效率較高且具有較高 的安全性（參見文南犬5:MadryH,CucchiariniM.Clinicalpotentialandchallenges ofusinggeneticallymodifiedcellsforarticularcartilagerepair.CroatMed J. 2011Jun;52 (3):245-61)。慢病毒基因載體是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒載 體，作為一種高效的基因轉(zhuǎn)染載體應(yīng)用越來越廣泛，經(jīng)多次修飾改造其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和安全性 都得到了保證。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供了鏈接粘附分子JAM-A的新用途，具體是在制備皮膚創(chuàng) 面修復(fù)藥物或試劑中的應(yīng)用。
[0010] 所述的藥物或試劑，能夠提高鏈接粘附分子JAM-A的表達(dá)量，包括但不限于以下 任一：
[0011] A) JAM-A及其編碼基因；
[0012] B)含有JAM-A編碼基因的重組載體；
[0013] C)含有JAM-A編碼基因的重組病毒；
[0014] D)含有JAM-A編碼基因的重組病毒載體。
[0015] 所述的鏈接粘附分子JAM-A(NM_016946)，其cDNA序列如SEQIDNO: 1所示。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，提高鏈接粘附分子JAM-A表達(dá)量的藥物或試劑是 指重組載體 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0017] 所述的皮膚創(chuàng)面修復(fù)，其中的"創(chuàng)面"是正常皮膚（組織）在外界致傷因子如外科 手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo) 致的損害；常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時(shí)，皮膚的正常功能受 損；也稱為傷口或者創(chuàng)傷。創(chuàng)面修復(fù)也稱為傷口修復(fù)、創(chuàng)面愈合等，是指皮膚（組織）通過 再生（Regeneration)、修復(fù)（Repair)、重建（Reconstruction)，不同程度地恢復(fù)其功能。
[0018] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的方法。
[0019] 本發(fā)明的一種促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的方法，是采用提高鏈接粘附分子JAM-A表達(dá)量 的藥物或試劑修飾創(chuàng)面皮膚。
[0020] 所述的修飾，較優(yōu)的，是用皮下注射的方式將提高鏈接粘附分子JAM-A表達(dá)量的 藥物或試劑注入創(chuàng)面皮膚組織；
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，是用皮下注射的方式將重組載體 pGC-FU-JAM-A-GFP移植到創(chuàng)周皮膚組織。
[0022] 本發(fā)明的一種促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的方法，該方法包括：構(gòu)建一種JAM-A高表達(dá)的 重組載體，包括但不限于pGC-FU-JAM-A-GFP，通過皮下注射的方式移植到皮膚創(chuàng)面四周。
[0023] 本發(fā)明的pGC-FU-JAM-A-GFP主要感染創(chuàng)面皮膚中的成纖維細(xì)胞和毛囊的結(jié)締組 織鞘的細(xì)胞。
[0024] 本發(fā)明的第三方面，提供一種鏈接粘附分子JAM-A基因表達(dá)的載體，并提供該載 體在制備皮膚創(chuàng)面修復(fù)藥物或試劑中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明的一種鏈接粘附分子JAM-A基因表達(dá)的載體，可以是一種含有JAM-A編碼 基因的重組載體、一種含有JAM-A編碼基因的重組病毒、一種含有JAM-A編碼基因的重組病 毒載體等。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的鏈接粘附分子JAM-A基因表達(dá)的載體為 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0027]本發(fā)明提供了 一種重組載體pGC-FU-JAM-A-GFP，并檢測了該載體促創(chuàng)面修復(fù)的能 力及生物安全性等。本發(fā)明還進(jìn)一步提供采用PGC-FU-JAM-A-GFP促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的方法，以 及pGC-FU-JAM-A-GFP在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明基于前期JAM-A可促進(jìn)細(xì)胞迀移，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞重排等實(shí)驗(yàn)依據(jù)，構(gòu)建含 目的基因JAM-A慢病毒過表達(dá)載體，將其定向定量注射至創(chuàng)周，以便用啟動(dòng)表達(dá)外源性的 JAM-A，獲得JAM-A高表達(dá)創(chuàng)面組小鼠，稱之為JAM-A° v-mice。將5 X 105的pGC-FU-JAM-A -GFP慢病毒顆粒采用創(chuàng)周四點(diǎn)皮內(nèi)注射的方式移植到全層皮膚缺損的小鼠，注射時(shí)間為創(chuàng) 傷后24小時(shí)。注射后觀察并統(tǒng)計(jì)創(chuàng)面恢復(fù)情況。
[0029] 本發(fā)明提供一種JAM-A基因感染創(chuàng)周皮膚的方法，具體內(nèi)容是根據(jù)JAM-A的基 因結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以人表皮細(xì)胞總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增，制備JAM-A cDNA， 再構(gòu)建重組人peGFP-Nl-JAM-A真核表達(dá)載體，為提高轉(zhuǎn)染效率，構(gòu)建慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0030] 本發(fā)明提供了一種鏈接粘附分子JAM-A過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟 (即 pGC-FU-JAM-A-GFP 的構(gòu)建方法）：
[0031] A、設(shè)計(jì)并合成引物P1和P2,擴(kuò)增JAM-A cDNA :
[0032] PI ：CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC(SEQ ID NO:2)
[0033] P2：ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG(SEQ IDNO:3)
[0034] 以人表皮細(xì)胞總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增，制備JAM-A cDNA，序列如下：atcg cgatggggacaaaggcgcaagtcgagaggaaactgttgtgcctcttcatattggcgatcctgttgtgctccctggca ttgggcagtgttacagtgcactcttctgaacctgaagtcagaattcctgagaataatcctgtgaa