一種益智葉提取物及其制備方法、應用
【技術領域】 本發明屬于植物提取技術領域，具體涉及一種益智葉提取物及其制備方法、應用。
【背景技術】[0002] 糖尿病（DM)是由遺傳和環境因素相互作用所導致的復雜的內分泌疾病，即是胰島素相 對和/或絕對分泌不足(包括0細胞衰變、功能降低或/和胰島素抵抗)，而引起的糖、蛋 白質、脂肪和繼發的水、電解質等一系列代謝紊亂性疾病。常分為型、II型及妊娠期糖尿 病。糖尿病患者可出現葡萄糖耐量降低、高血糖、尿糖及胰島素釋放試驗異常，臨床表現為 多飲、多食、多尿及體重減輕(三多一少)，即煩渴、易饑、消瘦、疲乏無力等癥狀。
[0003] 糖尿病引起血糖升高，可以加快葡萄糖的有氧氧化，增強蛋白的非酶糖基化作用 和導致脂代謝異常，使體內存在一定程度的氧化應激和脂質代謝紊亂。氧化應激會使外周 組織對胰島素的敏感性下降，葡萄糖的利用降低。此外，氧化應激還會加劇胰島0細胞凋 亡，胰島細胞數目減少，降低胰島素的合成與分泌，使糖代謝異常進一步加劇。因此，氧化應 激在糖尿病的病理衍變中起重要作用。可見，高血糖會引起糖尿病患者抗氧化系統紊亂，產 生氧化應激，反過來氧化應激又會影響糖代謝，由此形成惡性循環。
[0004] 益智（WjOiWa Miq.)，系姜科（Zingiberaceae)山姜屬（WjOiWa Roxb.)植物，主要分布于我國海南、廣東、廣西等地。其干燥成熟果實益智（Fructus AlpiniaeOxyphyllae)被譽為四大南藥之一，具有十分重要的藥用價值，且屬于藥食同源 品種，因此具有十分廣闊的開發前景。益智果實作為一門傳統中藥，被歷版《中國人民共和 國藥典》收載，其味辛、性溫，歸脾、腎經。有溫脾止瀉，攝唾涎，暖腎，固精縮尿的功能。主治 脾寒泄瀉，腹中冷痛，口多唾涎，腎虛遺尿，小便頻數，遺精白濁。
[0005] 近年來，對益智（J力Miq.)的研究報道較多，也更系統，其中主要 是對益智果實的研究。益智果實的傳統功效被我國歷代中醫藥學家熟練地運用于臨床，而 近年來對其又有了新的進展。現代藥理學研究表明，益智果實還具有舒張血管、強心、抗癌、 抗過敏、抗氧化、抗衰老、抗潰瘍、鎮靜、鎮痛、提高免疫力以及神經保護等多方面藥理活性。 益智果實中主要成分為倍半萜類、其次為黃酮類、二芳基庚烷類、留醇及其苷類化合物。
[0006] 查閱大量文獻可發現，對益智的葉子研究報道較少。益智為多年生草本植物，每年 結果后大量的莖葉部位廢棄不用，結果五、六年后益智結果能力開始衰退，導致了資源不能 合理利用。張俊清等對不同生長期益智果實、根莖及莖葉中化學成分的研究發現，在果實整 個生長周期，二苯基庚烷類、萜類等化學性成分主要富集在益智果實中，而黃酮類化學成分 基本均勻分布在益智的果實、根莖及莖葉中。易美華等研究發現，經提取揮發油后的益智果 實及其莖、葉的提取物對豬油脂質均有較強的抗氧化作用；且均對超氧陰離子自由基有清 除作用，清除能力依次為：益智的葉、益智的莖、提取揮發油后的益智果實。但關于治療糖尿 病方面的研究并未見報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種具有預防、治療糖尿病作用的益智葉提取物，同時提供該 提取物的制備方法。
[0008] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案： 一種益智葉提取物的制備方法，包括以下步驟：取益智葉，加入乙醇，加熱提取，提取的 液體經濃縮干燥得乙醇總浸膏；將乙醇總浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁 醇萃取，各個萃取液揮干溶劑，分別得到石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇 部位萃取物。
[0009] 乙醇的濃度為60-75V%，加熱提取時溫度控制在50-60°C，提取3次，每次l-3h。
[0010] 根據上述制備方法制得的益智葉提取物，為益智葉的石油醚部位萃取物、乙酸乙 酯部位萃取物和/或正丁醇部位萃取物。
[0011] 益智葉提取物在制備預防、治療糖尿病藥物或保健品方面的應用。
[0012] 本發明為證實上述益智葉提取物的降糖作用，采用了體外a _葡萄糖苷酶活性抑 制作用，選擇抑制活性好的溶劑萃取物進行體內實驗，體內采用的是四氧嘧啶誘導小鼠糖 尿病模型。體外結合體內實驗，主要檢測了糖尿病小鼠的血糖值(給藥前空腹血糖、給藥后 空腹血糖、給藥后餐后血糖)、肝糖原含量、血清中丙二醛(MDA )含量、超氧化物歧化酶（S0D ) 活力等生化指標，共同考查其對糖尿病的預防、治療作用。結果表明，益智葉乙酸乙酯部位 萃取物及正丁醇部位萃取物，在體外和體內均有一定降糖作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1為益智葉不同萃取物不同濃度對a-葡萄糖苷酶活性的影響； 圖2位益智葉不同萃取物不同劑量對小鼠體重的影響。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1 : 益智葉提取物由以下方法獲得：取3400 g干燥益智葉，剪碎后，加入75V%乙醇，55°C提 取3次，每次3 h，每次加入的乙醇體積均以完全浸沒益智葉為準，過濾，合并濾液，濃縮干 燥即得益智葉乙醇總浸膏(提取率為23. 33%);將此總浸膏分散于少量水中，依次用等體積 的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別收集萃取液，各個萃取液揮干溶劑，分別得到石油醚 部位萃取物(提取率1. 41%)、乙酸乙酯部位萃取物(提取率9. 42%)和正丁醇部位萃取物(提 取率 11. 71%)。
[0015] 實施例2 : 益智葉提取物由以下方法獲得：取3400 g干燥益智葉，剪碎后，加入70V%乙醇，50°C提 取3次，每次2h，每次加入的乙醇體積均以完全浸沒益智葉為準，過濾，合并濾液，濃縮干燥 即得益智葉乙醇總浸膏；將此總浸膏分散于少量水中，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、 正丁醇萃取，分別收集萃取液，各個萃取液揮干溶劑，分別得到石油醚部位萃取物(提取率 1. 23%)、乙酸乙酯部位萃取物(提取率10. 11%)和正丁醇部位萃取物(提取率11. 08%)。
[0016] 實施例3: 益智葉提取物由以下方法獲得：取3400 g干燥益智葉，剪碎后，加入60V%乙醇，60°C提 取3次，每次lh，每次加入的乙醇體積均以完全浸沒益智葉為準，過濾，合并濾液，濃縮干燥 即得益智葉乙醇總浸膏；將此總浸膏分散于少量水中，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、 正丁醇萃取，分別收集萃取液，各個萃取液揮干溶劑，分別得到石油醚部位萃取物(提取率 1. 53%)、乙酸乙酯部位萃取物(提取率9. 65%)和正丁醇部位萃取物(提取率10. 96%)。
[0017] 效果實驗一：益智葉不同萃取物的體外抑酶活性試驗 本發明選用的是以4-硝基酚-a -D-吡喃葡萄糖苷為底物的酶抑制劑篩選模型，體外 考察對a-葡萄糖苷酶活性抑制作用。
[0018] 樣品溶液的配制 分別稱取實施例1制得的一定質量的石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物、正丁 醇部位萃取物，加入一定體積的DMS0,配成初濃度為30 mg/mL的樣品溶液。
[0019] 陽性參考藥物阿卡波糖的配制同各萃取物。
[0020] 檢測方法及數據處理 實驗組設置如下： 空白對照組：8 y L DMS0+152 y L磷酸鉀緩沖液，于405 nm波長下測0D值； 空白組：8 yLDMSO+112 yL磷酸鉀緩沖液+20 yL 〇?-葡萄糖苷酶+20 yLPNPG， 于405 nm波長下測0D值； 樣品對照組：8 y L樣品溶液(含阿卡波糖）+152 y L磷酸鉀緩沖液，于405 nm波長下 測0D值； 樣品組：8 y L樣品溶液(分別含石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物、正丁醇部 位萃取物）+20 yL a-葡萄糖苷酶+112 yL磷酸鉀緩沖液+20 yLPNPG，反應結束后于 405 nm波長下測0D值；（具體過程：112 yL磷酸鉀緩沖液（pH 6. 8)，加入濃度為0.2 U/ 11^〇'-葡萄糖苷酶2〇1^、8 1^相應濃度的樣品溶液，37°(：恒溫15 111111，加入2〇1^2.5 mmol/L PNPG，37°C恒溫反應15 min。再加入80 yL、濃度為0. 2 mol/L的終止劑似20)3溶 液，于405 nm波長下測0D值。) 同時做相同體系下的空白對照組、空白組、樣品對照組、樣品組，每組重復3次，按下面 計算公式計算抑制率，并用Origin 6. 0軟件求出相應的IC5。值。
[0021] 分別采用上述方法測定了益智葉石油醚部位萃取物、乙酸乙部位酯萃取物和正丁部 位醇萃取物，及陽性參考藥物阿卡波糖等試樣的抑制率及IC5。值。
[0022] 實驗結果
注：NT :未測定。
[0023] 阿卡波糖為陽性參考藥物。
[0024] 由表1可看到，在體系濃度達到1500Pg/mL時，益智葉石油醚部位萃取物對a-葡 萄糖苷酶活性的抑制率僅為37. 52 ± 1. 40%，并未達到50%，因此并未測出其IC5。值，且也 并未在圖1中顯示出其趨勢圖。表1中，在體系終濃度為1500 Pg/mL時，益智葉乙酸乙酯 部位萃取物和其正丁醇部位萃取物的抑制率（101. 13 ± 1.51%，91. 44 ± 1.55%)均大于 陽性參考藥物阿卡波糖（62.62 ± 2. 21%)，且前兩者的活性（IC5Q=55.00 ± 0. 23噸/mL， 345. 70 ± 2. 51 Pg/mL)也均大于陽性參考藥物阿卡波糖（IC5(]=1130. 00 ± 52. 94噸/ mL)。由表1和圖1可看到，乙酸乙酯部位萃取物對a -葡萄糖苷酶活性的抑制作用最好， 其次是正丁醇部位萃取物。
[0025] 效果實驗二：益智葉不同萃取物對糖尿病小鼠的影響 2. 1實驗方法 小鼠糖尿病模型實驗方法，采用的是四氧嘧啶（alloxan)誘導小鼠致糖尿病，其作用 機制主要是選擇性損傷胰腺0細胞，引起細胞壞死，導致血胰島素不同程度下降伴血糖升 高，形成糖尿病。雄性KM小鼠90只，體重16~20 g，自由采食與進水，喂養一周適應環 境后，體重達到25±2 g，分組染色，禁食不禁水10 h后，尾靜脈注射四氧嘧啶（80 mg/kg b.w.)，誘導小鼠胰島0細胞損傷，從而形成糖尿病模型。
[0026] 72 h后，小鼠內眥取血，離心，測定其空腹血糖值(表2)，血糖值大于16. 7 mmol/ L時，作為造模成功的標準。選擇造模成功的小鼠，按照血糖值均衡原則隨機分配7組，每 組10只，再次染色稱重。根據體外實驗結果，選擇活性好的萃取部位進行體內實驗，因此共 設7組