一種共擔載阿霉素和trail的白蛋白納米粒靶向制劑及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種載藥制劑及制備方法，特別是涉及一種共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑及制備方法。
【背景技術】
[0002]據世界衛生組織發布的《全球癌癥報告2014》預測，全球癌癥病例將呈現迅猛增長態勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，至2035年人數將增加到2400萬人。新增病例有近一半出現在亞洲，其中大部分在中國，中國每年新增癌癥患者307萬，死亡220萬，分別占全球總量的21.9%和26.8%。因此，抗腫瘤藥物的市場近年增長迅速，全球2008年到2013年的復合增長率7.2%，在中國這一復合增長率達到20.4%，遠高于全球增長水平。
[0003]當前治療的缺陷，化療是癌癥治療的有效手段，一般的化療藥物有極高的生物毒性而缺乏生物選擇性，在殺傷腫瘤細胞的同時，亦殺傷正常組織細胞。由于非特異毒性、缺乏腫瘤選擇性以及腫瘤的多藥耐藥性，對腫瘤的治療不能達到令人滿意的效果，甚至可能造成病人無法耐受而被迫停藥。因此如何利用載體輸送手段提高藥物的腫瘤靶向特異性，提高腫瘤組織對化療藥物的敏感性以及降低系統毒性成為研究的熱點。
[0004]美國生命科學公司(American B1science)開發的革El向化療藥物-無溶劑型紫杉醇白蛋白納米粒Abraxane?的問世激發了人們對白蛋白納米粒作為抗腫瘤藥物載體的研究熱情。白蛋白具有安全無毒、無免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特點，其獨特的靶向性和緩釋特性，使其在抗腫瘤藥物載體方面具有廣闊的應用前景。然而這種靶向作用相對較弱，且其耐藥腫瘤細胞療效較差，限制了其應用。為了進一步提高藥物的靶向治療作用，研究者在白蛋白外層偶聯或吸附腫瘤特異性親和配體使其具有主動靶向性。葉酸是葉酸受體的天然配體，而后者在多數惡性腫瘤中的表達明顯高于正常細胞。
[0005]因此，本發明以葉酸介導白蛋白納米粒的腫瘤主動靶向，可以顯著提高制劑在腫瘤部位的富集。
[0006]近年來，納米載體共載化療藥物與基因藥物的研究屢見報道，特別是在多藥耐藥(multidurg-resistance, MDR)腫瘤研究領域。共載基因與化療藥物聯合治療癌癥，相對傳統化療，該方法可以減少化療藥物的使用劑量，增加藥物在靶器官的分布量，以達到減輕毒副作用及提高療效的目的。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)家族成員之一，能選擇性的誘導腫瘤細胞、轉化細胞凋亡，而對正常組織無毒性，有望成為腫瘤治療的新方法，備受人們的關注。TRAIL單獨使用較易發生耐藥，其與化療藥物(如依托泊苷、順鉑、阿霉素和5-氟尿嘧啶)聯合均可見協同或累加效應，能導致細胞凋亡。
[0007]本發明涉及的白蛋白納米粒的另一個特點是具有腫瘤pH敏感釋藥特性，而且是逐級釋放所裝載的阿霉素和TRAIL，這主要是得益于層層自組裝(Layer-By-Layer SelfAssembly)制備技術的優勢。首先制備載阿霉素的白蛋白納米粒，然后在白蛋白表面首先吸附一層聚乙烯亞胺PEI (帶正電荷)，接著加入協同抗癌劑TRAIL，最后在外層再吸附一層羧甲基殼聚糖-葉酸復合物CMCS-FA (帶負電荷)。該設計的優勢是除了葉酸可以起到腫瘤靶向作用增加納米粒子在腫瘤富集外，外層的羧甲基殼聚糖還可以掩蔽PEI的正電荷，降低載體的毒性，而且在腫瘤細胞外的PH條件下羧甲基殼聚糖層恰好可以脫落，首先釋放出TRAIL被腫瘤細胞外層的受體識別后，引起腫瘤細胞凋亡，而暴露出的PEI使納米粒產生電荷翻轉，由負變正，提高了與細胞的親和力，促進載體的細胞內吞。此外，PEI在細胞內溶酶體捕獲質子，引起溶酶體破裂，釋放出阿霉素，進一步殺傷腫瘤細胞，因此產生協同抗癌作用。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑及制備方法，該白蛋白納米粒制劑具有葉酸介導的主動革巴向和腫瘤pH敏感釋藥的特點，該制備方法具有簡單易行，可層層組裝包載藥物，使活性藥物在腫瘤部位逐級釋放，產生協同抗癌作用的特點。
[0009]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
一種共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，該制劑由鹽酸阿霉素DOX.Η(:1、人腫瘤壞死因子細胞凋亡配體TRAIL、牛血清白蛋白BSA、聚乙烯亞胺ΡΕΙ、羧甲基殼聚糖-葉酸偶聯物CMCS-FA以及注射用水、交聯劑等制成的包載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向給藥系統；其中，所述白蛋白溶液濃度為1.0-5.0% (克/毫升)，阿霉素濃度
0.001%-0.1% (克/毫升)，白蛋白溶液pH值4.0-9.0 ,TRAIL和DOX的質量比為10:1-1:10，PEI和CMCS的質量比為1:2-1:6。
[0010]所述的共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，其使用的聚乙烯亞胺為線性或分枝狀結構，分子量在2 -25 kDa。
[0011]所述的共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，其使用的羧甲基殼聚糖的粘均分子量在20~100 kDa，脫乙酰度在80%~90%，羧甲基取代度在60%~80%。
[0012]所述的共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑，其使用的交聯劑為戊二醛。
[0013]一種共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，所述方法包括以下制備步驟:
(O制備載阿霉素的白蛋白納米粒
采用去溶劑交聯法制備阿霉素白蛋白納米粒，取BSA適量配制水溶液，用I摩爾每升的氫氧化鈉溶液調節PH至8.0。取BSA溶液I毫升，攪拌下向其滴加鹽酸阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分。然后，在攪拌下向上述溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，繼續攪拌2小時后，轉移到旋轉蒸發器內，在40°C真空條件下旋轉蒸發20分鐘以除去乙醇；得到的產物經10 0C,14000轉/分鐘條件下離心10分鐘，除去離心上清液，再用蒸餾水重復洗滌離心兩次，棄去上清液得到納米粒；然后向納米粒中添加適量蒸餾水，渦旋分散，得到載阿霉素的白蛋白納米粒；
(2)羧甲基殼聚糖-葉酸偶聯物(CMCS-FA)的合成:
取0.2克葉酸(FA)溶于10毫升二甲基亞砜中，向其中加入0.1克的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS )和0.2 g的N，N’ - 二環己基碳二亞胺(DCC)(FA/NHS/DCC摩爾比為1:2:2 )，室溫活化反應12小時，直到葉酸全部溶解；向上述溶液中加入1%的羧甲基殼聚糖(CMCS)的磷酸鹽緩沖液和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽EDC (CMCS/FA/EDC摩爾比為1:1:1)，繼續室溫避光攪拌16小時；然后向溶液中滴加氫氧化鈉調節pH至9.0，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液透析24小時，然后用水透析24小時后，凍干處理；
(3)制備共包載阿霉素和TRAIL的葉酸靶向白蛋白納米粒:
利用層層自組裝技術制備共擔載阿霉素和TRAIL的納米粒；取載阿霉素的白蛋白納米粒溶液I毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使納米粒表面電荷由負變正，攪拌混勻后加入10微克/毫升的TRAIL溶液，攪拌均勻后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液(pH8.0磷酸鹽緩沖液配制)使納米粒電荷由正變負，室溫攪拌30分鐘，即得。
[0014]所述的一種共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，步驟(I)中所述BSA溶液濃度為1.0-5.0% (克/毫升)，優選為1.0-2.0%。
[0015]所述的一種共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，步驟(I)中所述阿霉素濃度0.001%-0.1% (克/毫升)，優選為0.01-0.05%。
[0016]所述的一種共擔載阿霉素和TRAIL的白蛋白納米粒靶向制劑的制備方法，