人抗vegfr-2/kdr抗體的制作方法
【專利說明】人抗VEGFR-2/KDR抗體 發明領域
[0001] 本發明涉及結合VEGFR-2的抗體。所述抗體被用于治療腫瘤性疾病和過度增生病 癥，并且可將其單獨使用或與其它藥劑組合使用。
[0002] 相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2012年10月5日提交的美國申請No. 61/710,420的優先權，該美國 申請通過引用以其整體并入本文。
[0004] 發明背景
[0005] 血管生成是高度復雜的形成新血管的過程，其牽涉毛細血管內皮細胞的增生，以 及其從預先存在的血管的迀移和組織浸潤，細胞至管狀結構的組配，新形成的管狀組裝體 形成閉路循環血管系統的聯接或新形成的毛細血管的成熟。
[0006] 血管生成在正常生理過程包括胚胎發育、卵泡生長和傷口愈合中是非常重要的。 過度的血管生成還導致腫瘤性疾病和非腫瘤性疾病諸如年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視 網膜病和新生血管性青光眼中的新血管形成。利用雷珠單抗（樂明睛，LucentiS)靶向血管 內皮細胞生長因子（VEGF)的抗血管生成療法已被證明在延緩AMD的進展中是有效的。然 而，新血管形成是復雜的，并且多血管生成機制有可能作出貢獻。但仍然需要開發用于治療 與新血管形成相關的疾病的藥劑和療法。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明提供了結合VEGFR-2 (KDR)的人抗體及其片段。在一些實施方案中，所述抗 體阻斷配體（例如，VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E的一種或多種）對VEGFR-2的結合。 在一些實施方案中，所述抗體中和VEGFR-2的激活。所述抗體用于治療腫瘤性疾病，包括， 例如實體瘤和非實體瘤，以及過度增生病癥。因此，本發明提供了中和KDR的激活的方法， 抑制腫瘤生長（包括抑制腫瘤相關血管生成）的抑制的方法，以及治療血管生成相關病癥 的方法。本發明提供了具有結合于VEGR受體的人抗體或抗體片段的試劑盒。
[0009] 在一個實施方案中，本發明提供了包含⑶R-1H、⑶R-2H和⑶R-3H序列的分離的重 鏈可變區，其中：
[0010]⑴cdr-ih序列為Gftfswyx1MX2(seq id no: 185)，其中 V或 I，X2SgSl,
[0011] (ii)CDR-2H 序列為 SixiX2Sggx3Tx4YADSVKG (SEQ ID NO: 186)，其中 X1SySGJ2 為P或S，&為A或F，X 4為N或D，以及
[0012] (iii)CDR-3H 序列為 GNYFDY(SEQ ID N0:3)或 GLAAPRS(SEQ ID N0:11)。
[0013] 在一個實施方案中，本發明提供了包含⑶R-1L、⑶R-2L和⑶R-3L的分離的輕鏈可 變區，其中
[0014] (i)CDR-lL序列為 AGXALXAXeXASGEQ ID NO :187)，其中 X1SsajSIX2* D、E 或 Q，X3為 K、S、N、I 或 A，X 4為 G 或 R，X 5為 D、S、H、E 或 N，X 6為 E、Y、Q、R 或 N，X 7為 Y、 F 或 S 以及父8為 A 或 S ;或 SGSX !SNX2X3X4X5X6X 7X8 (SEQ ID NO : 188)，其中 X1S S 或 T，X 2為 I 或L，父3為E或G，X 4為T、S或N，X 5為N或Y，X 6為T、P、A或Y，X 7為V或L以及X 8為N、I 或 Y ;或 X1Gx2Sx3DX4GX5YDYVS (SEQ ID NO: 189)，其中 n，x4Si 或V 以及X5Ss或A，
[0015] (ii)CDR-2L 序列為 X1X2X3X4X5PS (SEQ ID NO :190)，其中 X1Sq'D、T、Y、S 或 A，X2 為D、N、S、T、V或V，父3為D、N、S、T或Y，X 4為Q、K、N或L以及X 5為R或L，以及
[0016] (iii)其中 CDR-3L 序列為 AX1WX2X3X4X5X 6X7X8 (SEQ ID NO: 191)，其中 X1S 厶或丁， 父2為D或G，X 3為R或無氨基酸，X 4為S、F或N，X 5為S、T或N，X 6為S、T或P，X 7為A、V、 UI 或 Y 以及 Xi^V或 L ;或 AX WDDX2LX3X4X5X6 (SEQ ID NO: 192)，其中 X1SAJSTJ2S N或 s，X3為n、I 或g，乂4為G或 s，X5Sp、w或 V 以及Xf^v或 L;或Mystitx1LUseq id NO :193)，其中 X1Sa 或 τ。
[0017] 在一個實施方案中，本發明提供了包含⑶R-1L、⑶R-2L和⑶R-3L的分離的輕鏈可 變區，其中
[0018] (i) CDR-IL 序列為 RASX1X2X3X4X5X 6X7YX8X9 (SEQ ID NO : 194)，其中父!為 Q、E 或 H，X2 為S、R或N，X3為V、I或L，X4S S、R、G或N，X 5為S或N，X 6為S、N、W或D，X 7為G或無氨 基酸，乂8為L或F以及X 9為A、G、M或S，
[0019] (ii)cDR-2L 序列為 Gasx1RM^seq id no :195)，其中 X1Ssjj 或 N，以及
[0020] (iii)CDR-3L序列為 QQXAXAXsXf^XjSEQ ID NO :196)，其中 X1SfSYJ2SDi G或Y，X3S S、T或N，X 4為S、L或W，X 5為P或無氨基酸，X 6為P或T，X 7為L、I、V、P、W或 Y以及Xi^T或S。
[0021] 在本發明的實施方案中，所述抗體為表2中顯示的抗體。在本發明的實施方案中， 所述抗體包含具有SEQ ID NO :4的重鏈可變結構域。在本發明的實施方案中，所述抗體包 含具有SEQ ID NO :28的輕鏈可變結構域。在本發明的另一個實施方案中，所述抗體包含具 有SEQ ID NO :32的輕鏈可變結構域。
[0022] 在本發明的實施方案中，所述抗體用于中和VEGFR2的激活的方法，包括將細胞有 有效量的所述抗體接觸。
[0023] 在本發明的另一個實施方案中，所述抗體用于抑制受試者的血管生成的方法，包 括施用有效量的抗體。在某些這樣的實施方案中，將所述抗體與有效量的rho相關激酶 2(R0CK2)拮抗劑一起施用。
[0024] 在本發明的另一個實施方案中，所述抗體用于治療受試者的贅生物或減少腫瘤生 長的方法，所述方法包括施用有效量的所述抗體。在某些這樣的實施方案中，將所述抗體與 有效量的表皮生長因子受體（EGFR)拮抗劑一起施用。在某些這樣的實施方案中，將所述抗 體與有效量的fms-樣酪氨酸激酶受體（flt-1)拮抗劑一起施用。在其它這樣的實施方案 中，將所述抗體與有效量的rho相關激酶（ROCK)拮抗劑一起施用。在其它這樣的施用方案 中，將所述抗體與有效量的基質金屬蛋白酶拮抗劑一起施用。
[0025] 附圖簡述
[0026] 圖IA-C分別顯示通過噬菌體展示鑒定的本發明的抗VEGFR2抗體的人重鏈、λ輕 鏈和κ輕鏈可變區序列。
[0027] 圖2顯示本發明的抗體對hVEGFR2 (頂）的結合以及含有hVEGFR2的結構域2和 3的構建體（中）。底圖框顯示配體（VEGF165)阻斷。
[0028] 圖3顯示本發明的Mab 101和102抑制過表達KDR(人VEGFR2)的豬主動脈內皮 (PAE)細胞中的VEGFR2、AKT和MAPK的VEGFA-刺激的磷酸化。
[0029] 圖4顯示Mab 104、105、106和108阻斷hVEGFR2和VEGF165配體的結合。在單獨 的實驗中對于Mab 103、107、109和110獲得相似的結果。這些Mab含有與不同輕鏈可變結 構域重組的MablOl的重鏈可變結構域。
[0030] 圖5顯示本發明的Mab 105和106抑制過表達KDR (人VEGFR2)的豬主動脈內皮 (PAE)細胞中的VEGFR2、AKT和MAPK的VEGFA-刺激的磷酸化。
[0031] 詳述
[0032] 在一個方面，本發明提供了新型VEGFR2抗體或應用對于抑制VEGFR2依賴性信號 轉導是有效的這樣的抗體的抗原結合片段。如本文中所用，"抑制受體"意指消除和/或滅 活受體的固有激酶活性以轉導信號。用于VEGFR2抑制的可靠測定是受體磷酸化的減少。
[0033] 本發明不受VEGFR2抑制的任何特定機制限制。被一種抗體所遵循的機制不一定 與被另一種抗體所遵循的機制相同。一些可能的機制包括阻止VEGF配體對VEGFR2的細胞 外結合結構域的結合和阻止受體的二聚化或寡聚化。然而不能排除其它機制。
[0034] 抗體是識別并結合特定抗原或物質的蛋白質。在優選實施方案中，本發明的抗體 結合KDR至少與結合天然配體一樣強。由抗原與抗體的解離的平衡常數（Kd)表示的親和 力測量抗原決定簇與抗體結合位點之間的結合強度。親合力是抗體與其抗原之間的結合強 度的量度。親合力涉及抗原決定簇與抗體上的抗原結合位點之間的親和力和每抗體結合位 點（效價）的數目。例如，單價抗體（例如，Fab)具有一個針對特定表位的結合位點。IgG 抗體具有2個抗原結合位點。K的典型值（解離常數心的倒數）為10 5至10 11升/mol。任 何比IO4升/mol弱的K被認為表示為非特異性的結合。
[0035] 本發明的抗體抑制VEGFR2的激活。VEGFR2抑制的一個量度為降低的受體的酪氨 酸激酶活性。酪氨酸激酶抑制可使用公知的方法來測量，諸如測量受體的自磷酸化水平。 還可通過天然或合成VEGFR2底物以及VEGFR2信號轉導途徑的其它組分的磷酸化事件的抑 制或調控來觀察VEGFR2的抑制。還可例如在ELISA測定中或western印跡上使用對于磷 酸酪氨酸是特異性的抗體檢測磷酸化。用于酪氨酸激酶活性的一些測定描述于Panek等， J. Pharmacol. Exp. Thera.，283 :1433-44(1997)和 Batley 等，Life Sci.，62 :143-50(1998) 中。
[0036] 還可使用體內測定。例如，可在抑制劑存在和不存在的情況下使用利用受體配體 刺激的細胞系，通過有絲分裂測定來觀察受體酪氨酸激酶的抑制。例如，利用VEGF刺激的 HUVEC細胞（ATCC)可用于測定VEGFR抑制。另一種方法包括使用例如注射入小鼠的人腫瘤 細胞測試表達VEGF的腫瘤細胞的生長的抑制。參見，美國專利No. 6, 365, 157 (Rockwell等 人）。
[0037] 本發明提供了抗VEGFR2抗體，包括編碼這樣的抗體的核酸和包含這樣的抗體的 組合物。在一個實施方案中，本發明提供了包含⑶R-1H、⑶R-2H和⑶R-3H序列的分離的抗 體重鏈可變區，其中：
[0038] ⑴CDR-IH序列為Gftfswyx1MX2(seq id no: 185)，其中 X1SvSij2SgSl,
[0039] (ii)CDR-2H 序列為 SixiX2Sggx3Tx4YADSVKG (SEQ ID NO : 186)，其中 X1S Y 或 G，X2 為P或S，&為A或F，X 4為N或D以及
[0040] (iii)CDR-3H 序列為 GNYFDY(SEQ ID N0:3)或 GLAAPRS(SEQ ID N0:11)。
[0041] 在一個實施方案中，本發明提供了包含⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3的分離的輕鏈可 變區，其中
[0042] ⑴ CDR-Ll 序列為 J1GX2X3LX4X5X 6X7X8S (SEQ ID NO :187)，其中 X1S S、Q 或 T，X2為 D、E 或 Q，X3為 K、S、N、I 或 A，X 4為 G 或 R，X 5為 D、S、H、E 或 N，X 6為 E、Y、Q、R 或 N，X 7為 Y、 F 或 S，以及父8為 A 或 S ;或 SGSX !SNX2X3X4X5X6X 7X8 (SEQ ID NO : 188)，其中 X1S S 或 T，X 2為 I或L，父3為E或G，X 4為T、S或N，X 5為N或Y，X 6為T、P、A或Y，X 7為V或L，以及X 8為N、 I 或Y ;或 X1Gx2Sx3DX4GX5YDYVS (SEQ