益生微生態制劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種益生微生物群落的制備技術。
【背景技術】
[0002] 該發明是基于衛生假說理論。衛生假說（hygiene hypothesis)是一種醫學的 假說，指因缺少接觸傳染源、共生微生物(如胃腸道菌群，益生菌）與寄生物，從而抑制了免 疫系統的正常發展，增加了免疫系統相關疾病發病率。衛生假說的相關報導，早在1870S， Blackley CH等就發現，貴族更易患花粉癥（過敏性鼻炎，Hayfever); 1966，Leibowitz報 導了在以色列，多發性硬化癥（multiple sclerosis)的發生率與清潔度正相關；到了 1989 年，Strachan發現兄弟姐妹較多的家庭，花粉癥較少發生，在總結前人的報導以及基于相 關調查數據，提出'hygiene hypothesis'這個概念。自2000年以來，多篇文章發表在世界 頂級醫學雜志《新英格蘭雜志》（N Engl J Med)及《柳葉刀》（The Lancet)，報導了過敏及 慢性炎癥在西方社會發生率越來越高，其發生率與清潔度相關。最近的報導表明，成人過于 清潔對于免疫系統的健康也具有較大影響，成人后過于清潔，花發粉癥等各種免疫系統疾 病的發病率顯著增加。
[0003] 研究衛生假說發生原因，有人發現無菌鼠免疫系發育不全，極微量的病原菌就可 以導致無菌鼠的感染死亡。人體中的微生物，腸道微生物最為豐富多樣，而胃腸道具有人體 最大的免疫組織，它包括派伊爾淋巴集結（peyer's patch )和腸系膜淋巴結（mesenteric lymph nod (MLN))，腸道微生物通過對該免疫組織的影響需影響著全身免疫系統的發育。
[0004] 發達國家青少年自身免疫性疾病與急性淋巴性白血病發病率的增加被認為與 衛生假說有關。一些證據表明自閉癥是由免疫疾病導致的。人類微生物組學（Human Microbiome Project, HMP)分別測序分析了四十位居住在鄉村和城市腸道微生物樣本， 發現居住在農村的被試腸道微生物群落中嗜酸乳桿菌（lactobacillus acidophilus ) LA 含量是城市居住著的3-5倍，LA具有合成維生素 K的功能。還有研究分析了具有變態反 應嬰兒與沒有變態反應的嬰兒腸道微生物的組成，發現健康嬰兒腸道內有大量的雙歧桿菌 (Bifidobacteria)和乳酸菌（lactobacillus)，而有變態反應的嬰兒則具有較多的梭狀芽 胞桿菌（clostridia)。另外，他們還發現來自于有變態反應嬰兒的Bifidobacteria誘導產 生較多的炎性因子，而來自于健康兒童的Bifidobacteria則誘導出更多的抗炎性因子。 [0005]目前的衛生假說研究進一步證明，衛生假說除與免疫系統疾病相關外，還與孤獨 癥、癌癥、糖尿病的發生相關。孤獨癥是近年來發生率逐年增加的一種大腦廣泛發育障礙， 患者多數生活不能自理，對家庭對社會帶來嚴重的負擔。美國發生率1975年為5000分之 一，而2012年已增長為1/88。究其原因，初步研究表明，其發生機理為：過于清潔導致免疫 系統紊亂，免疫因子分泌失調，而免疫因子是神經發育的重要調控因子，如長期使用干擾素 可引起抑郁癥。還有多項報導，過于清潔還可以導致白血病與皮膚病癌的發生。
[0006]目前我國大城市居民過敏性鼻炎的發病率已經上升到了 10%左右，其他類似的過 敏性疾病，包括枯草熱、濕疹、哮喘和食品過敏等的發病率也逐年上升，正在向發達國家的 水平逼近。西方國家工業化之前，過敏性疾病同樣也是十分罕見的。可如今在英國、澳大利 亞和新西蘭等國，哮喘的發病率已經上升到了 20%，成為醫療系統的一大負擔。
[0007] 過于清潔易患免疫系統疾病，不清潔又容易引起各種感染，目前美國多個實驗室 開始研究治療方案，但市場上仍未見有相關產品推出。
【發明內容】
[0008] 本發明主要解決的技術問題是提供一種多元益生微生態制劑的制備方法。
[0009] 為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是： 提供一種益生微生態制劑的制備方法，包括如下步驟： (1) 收集健康動物消化道內容物或糞便； (2) 取蛋白類、脂類、碳水化合物類動植物素材按一定比例混合，磨碎成糊狀，高壓滅 菌，裝罐； (3 )將步驟（1)中所述消化道內容物或糞便接種于步驟（2 )制備得到的混合物中，在低 于42° C的厭氧條件下發酵，得到糞便發酵物； (4) 取部分所述糞便發酵物接種于步驟（2)制備得到的混合物中，在低于42° C的厭 氧條件下發酵，連續接種并發酵至少4次，得到發酵產物； (5) 高通量測序最后三次經步驟（4)處理后的發酵產物的微生物宏基因組中的細菌、真 菌或病毒類型，鑒定所述發酵產物中微生物的遺傳穩定情況； (6) 將經步驟（5)鑒定得到遺傳穩定的發酵產物低溫貯存備用。
[0010] 在本發明一個較佳實施例中，所述的益生微生態制劑為微生物群落制劑，所述群 落組成包括：細菌、真菌、古細菌、病毒和寄生蟲，但無病原微生物和致病性寄生蟲。
[0011] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（1)中的所述動物包括了脊椎動物和無脊椎動 物。
[0012] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（1)中的所述消化道是指口腔、腸腔、食管、胃或 腸道。
[0013] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（2)中的所述蛋白類、脂類、碳水化合物類素材 包括：動物源性、植物源性和微生物源性的蛋白類、脂類、碳水化合物。
[0014] 在本發明一個較佳實施例中，在步驟（4)中，糞便發酵物連續接種，直至微生物能 夠穩定遺傳。
[0015] 本發明的有益效果是： 1) 由本發明制備得到的益生微生態制劑含有多種益生腸道微生物，更有利于調節腸道 微生物，有利于刺激機體免疫系統的發育； 2) 本發明中的益生微生態可以長期培養，微生物種類與特性都可以了解清楚，具有藥 用價值的潛力； 3) 本發明中采用的原料充足、價格低廉； 4) 本發明制備簡單易于操作。
【具體實施方式】
[0016] 下面對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特征能更易于被 本領域技術人員理解，從而對本發明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0017] 實施例1羊瘤胃微生物發酵制劑的制備。
[0018] 技術方案： (1) 選取青玉米櫛、青三葉草、干花生秧、干玉米櫛、胡蘿卜、玉米、大豆，按照重量比分 別25 :10 :9 :21 :5 :21 :9進行粉碎后，混合均勻，加入1/3混合物重量的超純水，攪拌均勻， 高壓滅菌，制成培養基； (2) 選擇健康山羊，屠宰后立即取出羊瘤胃，并將瘤胃內容物收集于滅菌后的容器中， 置冰上轉移到無菌室； (3) 取部分羊瘤胃內容物樣本，抽提微生物宏基因組DNA，PCR法檢測瘤胃微生物是否 有常見病原微生物(細菌，真菌和病毒)，若無病原微生物則進入下一步實驗； (4) 無菌條件下，將約5克重量的瘤胃內容物接種于200克上述滅菌后的培養基中，并 將接種物與培養基混合均勻； (5) 將羊瘤胃內容物接種物置于嚴格厭氧37° C條件下發酵20天，每天無菌條件下至 少攪拌一次； (6) 將約5克上述發酵物接種于同樣的培養基中，同樣的條件下發酵20天；連續接種 最少4次； (7) 分別取最后三次發酵物200mg，酚氯仿法或者采用糞便微生物試劑盒提取宏基因組 DNA ； (8) 采用高通量測序儀測序細菌16S rRNA的方法，分析發酵物細菌種類與各種細菌的 含量；分析微生物的穩定遺傳情況； (9) 如果發酵物細菌群落已能相對穩定傳代，在-80° C的條件下保存備用。
[0019] 本實施例的檢測結果如下表所示： 表1.羊瘤胃微生物發酵制劑中含量為前20種菌屬類型與含量。
上表為高通量測序細菌16s rRNA基因結果。其中S5表示羊瘤胃內容物第5次接種， S6為羊瘤胃第6次接種，S7為羊瘤胃第7次接種。
[0020] 實施例2豬盲腸微生物發酵制劑的制備。
[0021] (1)選取青玉米櫛、青三葉草、玉米、大豆，按照重量比21 :9 :49 :21進行粉碎，然后 混合均勻，加入1/3混合物總重量的超純水，攪拌均勻，高壓滅菌，制成培養基； (2) 選擇健康成年豬，屠宰后取出盲腸，并將盲腸內容物收集于滅菌后的容器中，置冰 上轉移到無菌室； (3) 取部分盲腸內容物樣本，抽提微生物宏基因組DNA，PCR法檢測盲腸微生物是否有 常見病原微生物(細菌，真菌和病毒)，無病原微生物進入下一步實驗； (4) 無菌條件下，將約5克重量的盲腸內容物接種于200克上述滅菌后的培養基中，并 將接種物與培養基混合均勻； (5) 將盲腸內容物接種物置于嚴格厭氧37° C條件下發酵20天，每天無菌條件下至少 攪拌一次； (6) 將約5克上述發酵物接種于同樣的培養基中，同樣的條件下發酵20天；連續接種 最少4次。
[0022] (7)分別取最后三次發酵物