醫用金屬植入體表面殼聚糖季銨鹽/膠原復合涂層的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫用金屬植入體表面涂層的制備方法，尤其是醫用金屬植入體表面的礦化膠原涂層的制備方法。
【背景技術】
[0002]在骨修復過程中，體內自身細胞在不同時期產生不同的生長因子以調控骨整合過程順利進行，生長因子的釋放行為常常決定骨修復是否成功。因此，對于新型金屬植入體材料，其不僅應具有較好的生物相容性，更應具有較好生長因子或者藥物的承載能力以及對其承載的生長因子等釋放行為具有可控的能力。通常是在金屬植入體表面涂覆一層具有緩釋功能的有機物質同時嵌入生長因子劑來滿足生物相容性、生長因此承載能力以及釋放行為控制的要求。但是，涂覆一層具有緩釋功能的有機物涂層來控制生長因子釋放行為，常常需要多步、復雜的制備手段，限制了其在植入體表面修飾中的應用。
[0003]目前，在金屬基體上制備有機涂層的方法主要有電化學沉積法、旋涂法、和仿生沉積法。其中，電化學沉積法具有反應條件溫和，涂層化學組成和厚度可控等優點，在涂層制備方面的應用廣泛。中國專利CN101545886B采用電位階躍方法使導電聚合物中的氯金酸還原為納米金粒子，然后固定生物敏感物質形成復合敏感膜。但是基于電位階躍法，采用交變電位沉積法調控殼聚糖季銨鹽在膠原涂層中的分布的研宄未見報道。殼聚糖季銨鹽在較廣的PH范圍內帶有正電荷，其對電場的響應迅速，通過采用交變電位沉積法，可以調控殼聚糖季銨鹽的沉積行為，實現殼聚糖季銨鹽在膠原涂層中的空間分布可控，進而有效控制生長因子的釋放行為，對于提高骨修復速度和質量具有重要意義。
[0004]膠原蛋白是自然骨中主要的組成成分之一，其分子中裸露的官能團具有的信號傳遞作用，因而具有較好的生物相容性。但膠原蛋白涂層對生物因子等的承載能力有限。有許多研宄致力于提高承載能力，如中國專利CN103074659A利用恒電位電沉積法在礦化膠原涂層中引入了殼聚糖，提高了涂層藥物、生長因子等承載能力。中國專利CN102028969A利用恒電位電沉積法在植入體表面自下而上依次構建有致致密殼聚糖層、多孔礦化殼聚糖層和礦化膠原/殼聚糖交聯體層，提高了涂層的生物學性能和載藥性能。但根據礦化膠原沉積機理，電化學沉積過程中基板附近會產生PH梯度，殼聚糖在沉積到涂層的一定深度隨著PH升高后失去質子，失去質子的殼聚糖對電場的響應性急劇下降，不能可控調節殼聚糖富集在礦化膠原涂層的里層或者外層，限制了涂層對生長因子等承載空間位置的控制，同時失去質子的殼聚糖與生長因子之間的庫侖力急劇下降，使得整個涂層對生長因子等的承載能力提尚有限。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種工藝簡單、具有高生物學響應性和高效生長因子承載能力以及生長因子釋放行為可控的醫用金屬植入體表面殼聚糖季銨鹽/膠原復合涂層的制備方法。
[0006]本發明的醫用金屬植入體表面殼聚糖季銨鹽/膠原復合涂層的制備方法，包括以下步驟:
1)將殼聚糖季銨鹽溶于蒸餾水中，配制濃度為0.5g/L的殼聚糖季銨鹽水溶液，置于4°C待用；將I型膠原溶解于0.005mol/L醋酸中，配制濃度為0.5g/L的膠原醋酸溶液，置于4°C待用；
2)配制電解液:將含鈣化合物溶于水中，配制成濃度為10mmol/L~100mmol/L的含鈣水溶液；將含磷化合物溶于水中，配制成濃度為10mmol/L~100mmol/L的含磷水溶液；將含鈣水溶液和含磷水溶液攪拌混合，得到A溶液，將步驟I)制得的I型膠原醋酸溶液和殼聚糖季銨鹽水溶液與A溶液混合，使混合液中鈣、磷、膠原、殼聚糖季銨鹽的季銨根濃度分別為4 ?8mmol/L、8 ?16 mmol/L、0.3g/L、0.32—0.016mmol/L，調整電解液 pH 值為 4.3 ?4.6 ;
3)將電解液置于溫度為37°C的恒溫槽中，以鉑片作為對電極，以酸清洗處理過的金屬基板作為工作電極，兩電極之間距離為I?2cm，采用多電位階躍模式進行電化學沉積，施加在金屬基板上的正電壓為2.0?2.8V，負電壓為-1.5—2.5V，階躍段數為3~7段，每段沉積時間為l_20min，取出金屬基板，用去離子水清洗后待用；
4)配制0.l~2yg/mL的生物因子溶液，調節生物因子溶液的pH為3~10，將3)制備的金屬基板浸泡在生物因子溶液中，1-3天后取出，于37°C下干燥。
[0007]本發明中，所述的殼聚糖季銨鹽是季銨根取代度為20%~99%，分子質量為1000-100000的2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖或季銨根取代度為20%~99%，分子質量為1000-100000的N，N, N-三甲基殼聚糖季銨鹽。
[0008]本發明中，所述的I型膠原為倍菱液態I型膠原。
[0009]本發明中，所述的生物因子是pH為3~10帶有負電荷的BMP-2、BMP-6或BSA。
[0010]本發明中，所述的含鈣化合物可以是Ca(NO3)2.6H20或CaCl2。
[0011]本發明中，所述的含磷化合物可以是冊況?04或NaH2P04。
[0012]本發明中，所述的金屬基板可以是鈦板、鉭板或鎂板。
[0013]本發明采用多電位階躍模式進行電化學沉積，實現醫用金屬植入體表面的高生長因子承載、高細胞響應的殼聚糖季銨鹽/膠原復合涂層，通過調整每段階躍工作電極電位的正負、大小以及每段沉積時間，無需多次沉積，可快速簡易地實現將殼聚糖季銨鹽分布到膠原涂層不同空間，即膠原涂層里層富集殼聚糖季銨鹽和膠原涂層外層富集殼聚糖季銨鹽。利用殼聚糖季銨鹽帶有正電荷的性質，將生物生長因子承載到膠原涂層不同空間位置，實現了生物生長因子釋放行為可控調節，同時增大了涂層承載生物生長因子的能力，在硬骨組織修復領域具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0014]圖1是鈦植入體表面復合涂層里層富集2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖形貌。
[0015]圖2是鈦植入體表面復合涂層外層富集2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖形貌。
[0016]圖3是鈦植入體表面復合涂層的里層/外層承載BMP-2能力對比圖。
【具體實施方式】
[0017]以下結合具體實例來說明本發明:
實施例1
1)將季銨根取代度為98%，分子質量為30000的2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶于蒸餾水，配制濃度為0.5g/L的殼聚糖季銨鹽水溶液，置于4°C待用；將倍菱液態I型膠原溶解于0.005mol/L醋酸中，配制濃度為0.5g/L的膠原醋酸溶液，置于4°C待用；
2)配制電解液:將Ca(NO3)2.6H20溶于水中，配制成鈣濃度為80mmol/L的Ca(NO3)2水溶液，將NH4H2PO4溶于水中，配制成含磷濃度為80mmol/L的NH 4Η2Ρ04水溶液，將Ca (NO 3) 2水溶液和NH4H2PO4水溶液攪拌混合，得到A溶液。將倍菱液態I型膠原、2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶液與A溶液混合，使鈣、磷、2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖中季銨根和膠原的濃度分別為8mmol/L、16 mmol/L、0.08mmol/L、0.3g/L，再用NaOH溶液調整電解液pH值為4.4 ；
3)以表面酸清洗處理后的鈦板作為工作電極，鉑電極作為對電極，兩電極間距為1cm，取15ml電解液置于在37 °C恒溫槽中，采用多電位階躍電化學沉積模式，施加在鈦基板上的電壓和時間分別為:-1.5V(120s)、-2.4V(180s)、2V(60s)、-2.4V(480s)、2V(120s)、-2.4V(720s)、2V (180s)，沉積后取出鈦基板，去離子水清洗后備用；
4)配制2μ g/mL的BMP-2溶液，調解pH為7，將上述制備的鈦基板浸泡在1mL BMP-2溶液中。3天后取出，于37°C烘箱中干燥，在鈦植入體表面得到里層載有BMP-2的2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/膠原的復合涂層，其形貌見圖1。里層是指復合涂層與鈦植入體表面直接接觸的這一側。
[0018]實施例2
1)將季銨根取代度為98%，分子質量為300