含羧基類聚合物基阿霉素兩親性大分子前藥合成、納米膠束制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種含羧基類聚合物基阿霉素兩親性大分子前藥合成、納米膠束制備方法及其應用，屬于生物醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002]阿霉素是一種蒽環類光譜抗腫瘤抗生素，周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。阿霉素能成功抑制多種惡性腫瘤，包括急性白血病、淋巴瘤、軟組織和骨肉瘤、兒童惡性腫瘤及成人實體瘤。阿霉素雖然抗瘤譜廣，療效好，但是由于靜脈注射后毒副作用較大，主要包括惡心、嘔吐、骨髓抑制、胃腸道不良反應和心臟毒性等而嚴重限制了阿霉素的臨床應用；阿霉素的另一主要缺陷是容易發生多藥耐藥，長期使用容易產生劑量依賴性；此外，阿霉素常見藥用形式是鹽酸阿霉素，因為阿霉素本身溶解度很低，不轉化成鹽的形式無法應用。而變成鹽酸鹽后，阿霉素的藥效學功能大幅下降，而給臨床應用帶來很大困難。因此，賦予阿霉素長循環特性、提高其水溶性、減小多藥耐藥性成為阿霉素臨床應用亟待解決的三大問題。
[0003]大分子前藥，指指通過共價鍵將低分子藥物連接到合適的大分子上，這種大分子前藥在體內經酶解或水解釋放出活性藥物而發揮藥效的化合物。大分子前藥能延長藥物的釋放時間，減少用量，降低毒副作用；可以使溶解性較低或者不溶于水的藥物的水溶性增加，能夠改善藥物的動力學，能夠減小多藥耐藥性。
[0004]兩親性的共聚物在水溶液中能自組裝形成膠束，疏水性的鏈段形成內核，親水性的鏈段形成外殼。疏水內核能包裹疏水性的藥物，親水外殼能起屏障和保護作用。一方面納米膠束可以穿透腫瘤缺損的血管內皮細胞進而進入腫瘤組織，且由于清除障礙而高濃度，長時間聚集在腫瘤組織中，進而產生增強滲透性和延長保留時間的效應，即為增強的滲透保留效應(enhanced permeability and retent1n effect,簡稱EPR)這使得納米膠束具有靶向性；另一方面納米膠束能夠進入體內，可以有效的減少人體網狀內皮系統巨噬細胞的吞噬，能夠穿越細胞間隙，可通過人體最小的毛細血管和血腦屏障而被細胞組織吸收。
[0005]大多數含羧基類聚合物是自然界中一類具有生物可降解性、生物相容性、低毒性和親水性的天然高分子材料，被廣泛用作生物醫用材料。因此，將阿霉素與含羧基類聚合物制備成大分子前藥并進一步形成兩親性納米膠束，對于提高阿霉素臨床療效具有顯著的意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是為克服阿霉素現有臨床應用的不足，提供一種含羧基類聚合物基阿霉素兩親性大分子前藥合成、納米膠束制備方法及其應用，該納米膠束以阿霉素為疏水內核，含羧基類聚合物為親水外殼，不僅解決了阿霉素在水中溶解度低的問題，有效降低了腫瘤細胞對阿霉素的耐藥性，增強其靶向性并降低毒副性，而且最終制劑不含增溶劑和有機溶劑，增加了用藥的安全性。
[0007]本發明的目的通過以下技術方案實現:該方法是先利用阿霉素上的氨基與含羧基類聚合物上的羧基通過酰胺縮合耦合成含羧基類聚合物基阿霉素大分子前藥，進而在溶液中利用阿霉素的疏水性和含羧基類聚合物的親水性自組裝成納米膠束。
[0008]上述含羧基類聚合物基阿霉素兩親性大分子前藥合成、納米膠束制備方法及其應用具體包括下述步驟:
[0009]1、多步法制備含羧基類聚合物基阿霉素兩親性大分子前藥以及納米膠束
[0010](I)含羧基類聚合物基阿霉素大分子前藥的制備
[0011]將含羧基類聚合物溶于攝氏40?70度的熱溶液中，10rpm攪拌半小時，調節pH至3.0?7.0，加入碳二亞胺類和羧基活化試劑10?20min, 10rpm攪拌30min。加入阿霉素溶液，40?60°C下反應8?24h。反應結束后冷卻至室溫，旋轉蒸發至1ml液體，將大分子前藥進行純化，然后真空干燥。
[0012](2)兩親性納米膠束的制備
[0013]將大分子前藥用蒸餾水溶解，于攝氏40?70度熱溶液10rpm攪拌24?48h.反應之后，自主裝成納米膠束。
[0014]步驟(I)中碳二亞胺類和羧基活化試劑包括:EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)、NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)、EDC?DMAP (4-N, N- 二甲基吡啶)、EDC-sulfo-NHS (N?羥基琥珀酰亞胺)、EDC-HOBT (1-羥基苯并三氮唑)、DDC (二環己基碳二亞胺)-H0BT、DCC-NHS, DCC-DMAP, DCC-sulfo-NHS、DIC (N，N- 二異丙基碳二亞胺)-HOBT組合，其中，投放比例為(摩爾比)含羧基類聚合物類:碳二亞胺類:活化劑=1:(1?10):(I?10);含羧基類聚合物與阿霉素的質量比為I?5:1 ;純化方法選自萃取、滲透、蒸餾、離子交換離心、過濾、沉淀的一種或幾種組合。
[0015]步驟(2)中使用方法為透析法、薄膜分散法、乳化溶劑揮發法或納米沉淀法。
[0016]2、一步法制備含羧基類聚合物基阿霉素兩親性大分子前藥以及納米膠束
[0017]將含羧基類聚合物溶于溶液中，40?60°C條件下10rpm攪拌半小時，調節pH至
3.0?7.0，加入碳二亞胺類和羧基活化試劑10?20min, 10rpm攪拌30min。加入阿霉素溶液，40?60°C下反應8?24h。反應結束后冷卻至室溫，旋轉蒸發至1ml液體，自主裝成納米膠束，將納米膠束進行純化。
[0018]以上步驟中碳二亞胺類和羧基活化試劑包括:EDC(1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)、NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)、EDC-DMAP (4-N, N- 二甲基吡啶)、EDC-sulfo-NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)、EDC_H0BT(1-羥基苯并三氮唑)、DDC( 二環己基碳二亞胺)-HOBT, DCC-NHS, DCC-DMAP, DCC-sulfo-NHS, DIC (N，N- 二異丙基碳二亞胺)-HOBT 組合，其中，投放比例為(摩爾比)含羧基類聚合物類:碳二亞胺類:活化劑=1:(1?10):(I?10);含羧基類聚合物與阿霉素的質量比為I?5:1 ;自組裝方法為透析法、薄膜分散法、乳化溶劑揮發法或納米沉淀法。純化方法選自滲透、離心沉淀的一種或幾種組合。
[0019]本發明的原理是:
[0020]本發明選用具有生物相容性、可降解性、安全無毒的天然高分子含羧基類聚合物與阿霉素進行耦合，以期望實現以下技術目標:(I)借助含羧基類聚合物上大量的羥基提高阿霉素的水溶性；(2)通過合成大分子前藥，賦予所得阿霉素大分子前藥以緩控釋效果，降低腫瘤細胞對阿霉素的耐藥性；(3)利用所得阿霉素大分子前藥的兩親性質，自組裝形成內為阿霉素，外為含羧基類聚合物的納米膠束，降低毒性，提高靶向性。
[0021]本發明相對于現有技術，具有如下優點:
[0022](I)本發明采用的原料之一一一天然含羧基類聚合物，來源豐富，具有生物相容性，生物可降解性，安全無毒。
[0023](2)本發明制備條件溫和、方法簡單、操作簡便、易于實施，最終制劑不涉及增溶劑和有機溶劑，安全可靠。
[0024](3)本發明所制備的含羧基類聚合物基阿霉素大分子前藥具有兩親性，自組裝形成以阿霉素為疏水內核，含羧基類聚合物為親水外殼的膠束納米粒子，可降低阿霉素在體內的生物毒性，延長釋放時間，降低腫瘤細胞對阿霉素的耐藥性，提高了藥物的生物利用度。
[0025](4)本發明制備的膠束粒徑均勻，大小在110?130nm，可以通過EPR效應選擇性的濃集與腫瘤組織，因而可以增加阿霉素的治療指數。
【附圖說明】
[0026]圖1為果膠-阿霉素大分子前藥的合成、納米膠束的制備示意圖。
[0027]圖2為果膠-阿霉素基膠束粒徑圖，納米平均粒徑在132nm左右。
[0028]圖3為果膠-阿霉素基膠束SEM電鏡圖。
[0029]圖4為果膠-阿霉素基膠束體外釋放曲線。
[0030]圖5為羧甲基殼聚糖-阿霉素大分子前藥的合成、納米膠束的制備示意圖。
[0031]圖6為羧甲基殼聚糖-阿霉素基膠束粒徑圖。
[0032]圖7為海藻酸-阿霉素大分子前藥的合成、納米膠束的制備示意圖。
[0033]圖8為海藻酸-阿霉素基膠束粒徑圖。
[0034]圖9為透明質酸-阿霉素大分子前藥的合成、納米膠束的制備示意圖。
[0035]圖10為透明質酸-阿霉素基膠束粒徑圖。
[0036]圖11為RGD多肽-阿霉素大分子前藥的合成、納米膠束的制備示意圖。
[0037]圖12為大豆蛋白-阿霉素大分子前藥的合成、納米膠束的制備示意圖。
【具體實施方式】
[0038]實施例1
[0039]制備果膠-阿霉素大分子前藥兩親性納米膠束
[0040](I)稱取50mg的低甲氧基果膠溶于25ml水，調節pH至4.5?5.5，攪拌30min,依次加入EDC和NHS，50°C反應30min，加入25ml 0.lmg/ml的阿霉素溶液，50°C反應24h.反應結束后，用旋轉蒸發儀把液體濃縮至10ml，用乙醇洗滌，離心去掉