一種負載表阿霉素的石墨烯量子點載藥體系及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種負載表阿霉素的石墨烯量子點載藥 體系，以及該體系在抗宮頸癌藥物方面的應用。
【背景技術】
[0002] 目前腫瘤臨床應用的主要問題是腫瘤的診斷與治療分離，在治療的同時不能充分 反映腫瘤患者臨床的動態過程，不能完全預測腫瘤的治療效果。傳統的化療藥物不能有效 區別腫瘤細胞和正常細胞，導致了毒性和不良反應，而且容易產生耐藥性。使用載藥體系， 可盡可能降低藥物的毒副作用，但需要光學特性監測藥物的體內分布及腫瘤的治療進展。 因此，集化療、示蹤顯像為一體的載藥體系的設計和應用有望解決這個難題。
[0003] 石墨烯是近年來新發現的碳基納米材料之一，因其具有巨大的二維平面結構、大 的比表面積、良好的生物相容性、長的體內循環時間、納米尺寸的結構特點，使其在藥物載 體方面擁有巨大的應用空間。但石墨烯片層間較強的范德華力及其疏水的特性，在生理條 件下容易團聚而喪失應用價值。因此，石墨烯應用于載藥體系必須具備下列條件：①必須進 行必要的功能化修飾，使其具有良好的水溶性及生物相容性；②作為藥物載體的石墨烯尺 寸必須合理，有利于石墨烯與細胞之間的物質交換；③石墨烯的用量在保證載藥量的前提 下應盡可能少，盡管修飾后的石墨烯對生物體沒有明顯毒性，但由于其結構穩定不易分解， 容易在某些組織中長時間沉積。然而，關于小尺度石墨烯-通常稱為石墨烯量子點（GQDs) 作為藥物載體的研宄還非常有限。
[0004] 石墨烯量子點具有光致發光性能，可以作為一種新型熒光二維碳納米材料，有望 構建具有載藥、示蹤顯像等多功能的納米載藥平臺。目前合成GQDs的方法主要有水熱 法、二次氧化法、強酸氧化法、微波分解法、電化學法和有機合成法等。當前對石墨烯量子 點的研宄主要集中于合成、表征、熒光發光研宄及生物標記應用。2006年，孫亞平等（Sun YP, Zhou B, Lin Y，et al, J Am Chem Soc 2006,128(24):7756)通過強酸回流得到的發光 效率高達20%的石墨烯量子點，沒有明顯體外/體內毒性，且熒光成像效果接近于傳統的 CdSe/ZnS 量子點。Tao 等人（Tao H，Yang K，Ma Z，et al，Small，2012,8(2):281)也通過小 鼠實驗發現石墨烯量子點在體內代謝快、毒性小、有望應用于體內成像。Wclav等（Stengl V，Bakardjieva S, Henych J, et al.，Carbon, 2013, 63:537)提出了一種一步合成、可放大 生產、低成本的方法，即在有機溶劑中對氧化石墨烯進行回流，得到了強綠色和藍色熒光的 石墨稀量子點。Wang 等（Wang Z H, Zhou C F, Xia J F，et al·，Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2013, 112:192)合成了強綠色的熒光石墨烯量子點，通過PEG修飾后的 GQDs-PEG可以作一種具有示蹤效果的優異的藥物載體。
[0005] 表阿霉素（EPI)作為一種抗生素類抗腫瘤藥物，用于治療宮頸癌已取得了較好的 效果。但是表阿霉素對宮頸癌細胞的選擇性較低，毒性較大，所以為了提高藥物負載率、降 低細胞毒性、提高生物相容性，使用藥物載體對表阿霉素進行負載，控制其釋放具有十分重 要的意義。
[0006] 目前，關于石墨烯量子點載藥的研宄較少，因此，開發一種工藝簡單、負載率高、低 毒、生物相容性好、熒光成像的石墨烯量子點載藥體系，并開展其對宮頸癌Hela細胞的毒 性研宄，對推廣納米藥物載體在宮頸癌治療中的應用具有重要意義。
[0007] 申請號為201310352511. 5、公開號為103432590A的發明專利申請《石墨烯量子點 核靶向載藥體系及其制備方法和應用》，提供了一種利用HUMMER法合成的氧化石墨烯水溶 液為起點物制備石墨烯量子點體系。與該專利申請通過π - π物理作用實現對表阿霉素 的負載不同：一方面，本發明采用水熱法合成的氨基化的綠色石墨烯量子點在物理包埋表 阿霉素時，可通過π - π物理作用實現對表阿霉素的負載；另一方面，本發明表阿霉素可 通過其結構中的-COOH基團與氨基化石墨烯量子點上的_順 2進行酰胺化反應，從而使表阿 霉素通過化學偶聯的方式與量子點載體共價連接，達到雙重載藥的效果。
[0008] 本發明采用綠色石墨烯量子點作為藥物載體、負載抗腫瘤藥物表阿霉素形成表阿 霉素石墨烯量子點載藥體系并對宮頸癌Hela細胞毒性分析，未見相關研宄報道。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的是提供一種能高效負載抗腫瘤藥物表阿霉素的石墨烯量子點體系 的制備方法。
[0010] 為實現本發明的目的，本發明的技術方案包括以下步驟：
[0011] 步驟1 :水熱法制備石墨烯量子點；
[0012] 利用有機化合物芘在熱濃硝酸條件下的硝化作用，稀釋過濾除酸后，得到黃色的 1，3, 6-三硝基花（1，3, 6-trinitropyrene);利用配制的NaOH溶液或者水合肼和氨水修飾 改性；通過超聲處理和高壓反應釜加熱合成水溶性石墨量子點產物GQDs ;最后過濾，在真 空條件下加熱干燥，得到純化的綠色石墨烯量子點GQDs ;
[0013] 步驟2 :將表阿霉素和石墨烯量子點水溶液添加到pH = 7. 4的PBS磷酸緩沖溶液 中，將混合液超聲分散，混合均勻，在黑暗中不斷攪拌，振蕩12~24h，獲得載有表阿霉素的 石墨烯量子點溶液；將此溶液離心，取沉淀物進行真空干燥，干燥后得到石墨烯量子點載藥 體系，備用；其中：表阿霉素在PBS磷酸緩沖溶液中的質量體積比為ImgdOml ;石墨烯量子 點在PBS磷酸緩沖溶液中的質量體積比為Img :10ml ;所得到的石墨稀量子點載藥體系中， 表阿霉素：石墨稀量子點質量比1:0. 5~1:2 ;
[0014] 步驟3 :將石墨烯量子點載藥體系進行藥物緩釋實驗；
[0015] 稱取石墨烯量子點載藥體系放入適量去離子水中，平均分成兩等分，將兩份混合 液分別置于PH = 5. 5和pH = 7. 4的磷酸緩沖溶液中，進行緩釋實驗；將溶液放在全溫度振 蕩培養箱中，每隔一定時間用移液槍量取樣品測定藥物釋放量，并且補加磷酸緩沖溶液； 表阿霉素的濃度為〇. 005~0. 02mg/ml，載藥體系的濃度為0. 2~lmg/ml ;
[0016] 步驟4 :將石墨烯量子點載藥體系與宮頸癌Hela細胞共培育，用MTT法檢測石墨 烯量子點載藥體系細胞毒性；
[0017] 在裝有石墨烯量子點載藥體系的EP管中，加入75%乙醇消毒，備用；將對數期生 長的Hela細胞接種于96孔板，利用DMEM高糖完全培養基進行培養；培養24h后，分別加入 不同濃度的石墨烯量子點載藥體系；同時設置只加入DMEM高糖完全培養基作為對照組，未 接種細胞作為空白組，每組設置6個復孔，分別繼續培養24h，每孔加入MTT溶液，培養箱內 繼續培養4h后，棄去孔內的培養基，然后每孔加入二甲基亞砜（DMSO)，置搖床避光低速振 蕩，使結晶物充分溶解；利用酶標儀在490nm波長下測定吸光值（OD)。
[0018] 步驟2中，表阿霉素和石墨烯量子點的質量比優選為1 :1。
[0019] 本發明還提供了 一種按照上述步驟所得到的產品。
[0020] 本發明的綠色石墨烯量子點采用水熱法合成，參見文獻:Wang L, Wang YL, Xu T, et al, Nature communications, 2014, 5:5357,依照現有技術制備純化的綠色石墨稀量子點 GQDs0
[0021] 本發明中的藍色石墨烯量子點由南京先鋒納米科技有限公司提供，采用有機合成 法制備，帶有氨基官能團，粒徑約2~5nm。
[0022] 本發明的表阿霉素石墨烯量子點載藥體系，分別在pH = 5. 5和pH = 7. 4的PBS 磷酸緩沖溶液的環境下制備。
[0023] 將 2 ~4mg EPI 和 2 ~4ml GQDs (mg/mL)分別添加到 pH = 5. 5 和 pH = 7. 4 的 PBS磷酸緩沖溶液（20~40ml)中，將混合液超聲分散，混合均勻，在黑暗中不斷攪拌，振蕩 12~24h，獲得載有表阿霉素的石墨烯量子點溶液。將此溶液離心，取沉淀物進行真空干 燥，干燥后得到的產物即為石墨烯量子點載藥體系（EPIOGQDs)。本發明所得的載藥體系為 表阿霉素和石墨烯量子點的復合物。
[0024] 本發明對石墨烯量子點載藥體系進行了藥物緩釋實驗。
[0025] 稱取石墨烯量子點載藥體系放入適量去離子水中，平均分成兩等分，將兩份混合 液分別置于PH = 5. 5和pH = 7. 4的磷酸緩沖溶液中，進行緩釋實驗。將溶液放在全溫度振 蕩培養箱中，每隔一定時間用移液槍量取樣