一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]退行性骨關節病又稱骨關節炎、退行性關節炎、老年性關節炎、肥大性關節炎等，實際上其并非炎癥，而是一種退行性病變，屬于關節提前老化，特別是關節軟骨的老化，由增齡、肥胖、勞損、創傷、關節先天性異常、關節畸形等諸多因素引起的關節軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生。多見于中老年人群，好發于負重關節及活動量較多的關節(如頸椎、腰椎、膝關節、髖關節等)。過度負重或使用這些關節，均可促進退行性變化的發生。臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、活動受限和關節畸形等。
[0003]目前退行性骨關節病的主要治療方法是減少關節的負重和過度的大幅度活動，以延緩病變的進程。例如肥胖患者應減輕體重，下肢關節病變患者可用拐杖或手杖等。理療及適當的鍛煉可保持關節的活動范圍，對控制急性期癥狀有所幫助。對晚期病例，目前公認的消除疼痛、矯正畸形、改善功能的有效方法是在患者全身情況能耐受手術的條件下行人工關節置換術，可以大大提高患者的生活質量。
[0004]但是不管是理療還是人工關節置換術，并不能從根本上修復損傷的關節軟骨，退行性骨關節病患者將終生帶病生存。體外實驗顯示間充質干細胞可以向軟骨細胞分化，動物實驗也提示間充質干細胞可以修復受損的關節軟骨。有學者提出從健康成人骨髓中分離間充質干細胞并用于修復受損的關節軟骨，但是抽取骨髓對人體有損傷，且抽取的骨髓量較少，有骨髓疾病時無法采集。各項研宄顯示，新生兒臍帶中含有大量的間充質干細胞，其生物學特性與健康成人骨髓來源的間充質干細胞相似，并且具有易于分離培養、增殖能力強、低免疫原性等優點，其已成為生物醫學工程領域的“明星細胞”。臍帶是胎兒娩出后的附屬產物，往往作為廢棄物丟掉或燒毀。采集臍帶過程很簡單，且采集時對胎兒及產婦沒有任何損傷。基于以上優點，我們認為臍帶來源的間充質干細胞可以替代骨髓來源間充質干細胞用于治療退行性骨關節病。
【發明內容】
[0005]基于上述原因，本發明為了克服現有技術的不足，通過長期的研宄，確定了一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑及其制備方法:以健康新生兒的臍帶為原料，原代分離培養并大規模擴增培養臍帶間充質干細胞，利用擴增后的臍帶間充質干細胞制備干細胞制劑，該制劑可直接用于臨床治療退行性骨關節病。
[0006]本發明是通過下述技術方案實現的。
[0007]一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑，以健康新生兒的臍帶為原料，原代分離培養并大規模擴增培養臍帶間充質干細胞，擴增后臍帶間充質干細胞用人血白蛋白和二甲基亞砜的復方電解質注射液重懸，反復吸吹混勻后，將細胞逐漸降低保存溫度冷凍成制劑。
[0008]優選地，上述治療退行性骨關節病的干細胞制劑，所述擴增后臍帶間充質干細胞通過7代擴增培養后制得。
[0009]優選地，所述治療退行性骨關節病的干細胞制劑，所述擴增后臍帶間充質干細胞用PBS重懸，反復吸吹混勻，再離心；離心結束后吸棄上清液；離心后擴增后臍帶間充質干細胞用含有2?5%人血白蛋白和10%二甲基亞砜的復方電解質注射液重懸，反復吸吹混勻后，將細胞凍存盒置于普通冰箱保存30?60min，繼續將細胞置于超低溫冰箱(_80°C )保存過夜，最后將細胞置于液氮罐(_196°C )中長期保存。
[0010]一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑的制備方法，經過以下步驟:
[0011]采集臍帶:取健康新生兒臍帶，48小時內運輸至實驗室處理；
[0012]原代培養:將臍帶滅菌消毒，去除臍靜脈與臍動脈，撕取臍帶華通氏膠，將華通氏膠置于離心管中；剪碎臍帶華通氏膠，加入臍帶間充質干細胞完全培養液，在細胞培養箱中培養；吸棄舊臍帶間充質干細胞完全培養液及華通氏膠，浸洗貼壁細胞；加入Trypsin-EDTA消化貼壁細胞；加入含有2% FBS的PBS重懸細胞，反復吸吹混勻后離心；離心結束后吸棄上清液，沉淀細胞即為原代培養的臍帶間充質干細胞(PO代)；
[0013]傳代培養1:將PO代臍帶間充質干細胞用適量臍帶間充質干細胞完全培養液重懸，用電動吸液器反復吸吹混勻后接種1.5?2.0X 16個細胞至底面積75cm 2的細胞培養瓶，補充臍帶間充質干細胞完全細胞培養液至每瓶15?20ml，將細胞培養瓶置于37°C、飽和濕度、5% CO2的細胞培養箱中繼續培養；臍帶間充質干細胞貼滿細胞培養瓶底面80%以上時，吸棄細胞培養瓶內舊臍帶間充質干細胞完全培養液，用10?20ml PBS浸洗貼壁細胞，吸棄洗滌液，加入Trypsin-EDTA消化貼壁細胞；加入含有2% FBS的PBS重懸細胞，反復吸吹混勻后離心；離心結束后吸棄上清液，沉淀細胞即為傳代培養的臍帶間充質干細胞(Pl 代)；
[0014]參照上述傳代培養I的方法，將臍帶間充質干細胞傳代至P3代，然后凍存P3代細胞建立臍帶間充質干細胞種子庫；
[0015]凍存細胞1:將P3代臍帶間充質干細胞用適量臍帶間充質干細胞凍存保護液重懸，反復吸吹混勻后分裝；將細胞置于常溫(20°C )放置的程序降溫盒中，再將程序降溫盒直接置于超低溫冰箱(_80°C )中保存過夜，最后將細胞置于液氮罐(_196°C )中長期保存；
[0016]復蘇細胞1:從液氮罐(_196°C )中取出細胞，細胞在37°C水浴解凍；解凍完成后，將細胞凍存液轉移至離心管內，加入20?30ml PBS重懸細胞，用反復吸吹混勻；離心；離心結束后吸棄上清液，沉淀細胞即為復蘇后的臍帶間充質干細胞(P3代)；
[0017]傳代培養2:將復蘇后的P3代臍帶間充質干細胞用適量臍帶間充質干細胞完全培養液重懸，用反復吸吹混勻后接種4.5?6.0X 16個細胞至底面積225cm2的細胞培養瓶，補充臍帶間充質干細胞完全培養液至每瓶45?60ml，將細胞培養瓶置于37°C、飽和濕度、5% CO2的細胞培養箱中繼續培養；臍帶間充質干細胞貼滿細胞培養瓶底面80%以上時，吸棄細胞培養瓶內舊臍帶間充質干細胞完全培養液，用20?30ml PBS浸洗貼壁細胞，吸棄洗滌液，加入Trypsin-EDTA消化貼壁細胞；加入含有2% FBS的PBS重懸細胞，反復吸吹混勻后離心；離心結束后吸棄上清液，沉淀細胞即為傳代培養的臍帶間充質干細胞(P4代)；
[0018]參照上述傳代培養2的方法，將臍帶間充質干細胞傳代至P6代，然后凍存P6代細胞已建立臍帶間充質干細胞半成品庫；
[0019]凍存細胞2:將P6代臍帶間充質干細胞用適量臍帶間充質干細胞凍存保護液重懸，用反復吸吹混勻后分裝；將細胞置于常溫(20°C )的程序降溫盒中，再將程序降溫盒直接置于超低溫冰箱(_80°C )中保存過夜，最后將細胞置于液氮罐(_196°C )中長期保存；
[0020]復蘇細胞2:從液氮罐(_196°C )中取出細胞，細胞置于37°C水浴解凍；解凍完成后，將細胞凍存液轉移至離心管內，加入30?40ml PBS，反復吸吹混勻；離心；離心結束后吸棄上清液，沉淀細胞即為復蘇后的臍帶間充質干細胞(P6代)；
[0021]傳代培養3:將復蘇后的P6代臍帶間充質干細胞用適量臍帶間充質干細胞完全培養液重懸，用反復吸吹混勻后接種2.7?3.6 X 17個細胞至底面積1272cm 2的細胞培養瓶，補充臍帶間充質干細胞完全培養液至每瓶250?360ml，將細胞培養瓶置于37°C、飽和濕度、5% CO2的細胞培養箱中繼續培養；臍帶間充質干細胞貼滿細胞培養瓶底面80%以上時，吸棄細胞培養瓶內舊臍帶間充質干細胞完全培養液，用180?200ml PBS浸洗貼壁細胞，吸棄洗滌液，加入Trypsin-EDTA消化貼壁細胞；加入含有2% FBS的PBS重懸細胞，反復吸吹混勻后離心；離心結束后吸棄上清液，沉淀細胞即為傳代培養的臍帶間充質干細胞(P7 代)；
[0022]制劑并凍存:將P7代臍帶間充質干細胞再用30?40ml PBS重懸，再用電動吸液器反復吸吹混勻；再離心，1000?1500rpm、5min、RT ;離心結束后吸棄上清液，繼續用30?40ml PBS重懸，繼續用電動吸液器反復吸吹混勻；繼續離心，1000?1500rpm、5min、RT ?’離心結束后吸棄上清液，按以下方法制備治療退行性骨關節病的干細胞制劑:將P7代臍帶間充質干細胞用助懸液重懸，使其細胞終密度為I?4X 17個/ml，用電動吸液器反復吸吹混勻后分裝4ml細胞懸液至容積為5ml的細胞凍存管中；將細胞凍存管置于細胞凍存盒內，再將細胞凍存盒置于普通冰箱(4°C )保存30?60min，繼續將細胞凍存夾置于超低溫冰箱(_80°C)保存過夜，最后將細胞凍存夾置于液氮罐(_196°C)中細胞凍存架上指定的細胞凍存位置長期保存。
[0023]從液氮罐(_196°C )中細胞凍存架上制定的細胞凍存位置取出細胞凍存盒，從細胞凍存盒中取出細胞凍存管，夾住細胞凍存管頭部并將細胞凍存管在37°C水浴中快速晃動；解凍完成后即可直接關節腔注射用于治療退行性骨關節病。
[0024]優選地，一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑的制備方法，所述原代培養中適合接種的華通氏膠組織塊數為48?60塊/75cm2。
[0025]優選地，所述的一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑的制備方法，所述臍帶間充質干細胞完全培養液為DMEM/F12(1: I)與FBS混合液，二者體積比為9: 1，配制時分別取9份DMEM/F12 (I: I)與I份FBS于室溫下直接混合，配制完成后冷藏于普通冰箱(4°C )中。需要使用時從普通冰箱(4°C )中取出并恢復至常溫(20°C )。
[0026]優選地，根據權利要求4所述的一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑的制備方法，凍存細胞步驟中所述臍帶間充質干細胞凍存保護液為DMSO與FBS混合液，二者的體積比為1: 9，配制時分別取I份DMSO緩緩滴入9份預先冷藏至4°C的FBS中，用電動吸液器吸吹混勻，配制完成后冷藏于普通冰箱(4°C )。需要使用時從普通冰箱(4°C )中取出直接使用。
[0027]優選地，根據權利要求4所述的一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑的制備方法，所述PO代傳代至P3代采用的是接種1.8 X 16個細胞至底面積75cm2的細胞培養瓶；所述P4代傳代至P6代采用接種5.4 X 16個細胞至底面積225cm2的細胞培養瓶；所述P6代傳代至P7代采用的是接種3.0X 16個細胞至底面積1272cm2的細胞培養瓶。
[0028]具體的，所述的一種治療退行性骨關節病的干細胞制劑的制備方法，所述P7代細胞制劑的助懸液為含有適量I?10