一種用于動物弓形蟲病預防的重組卡介苗及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明提供了一種用于動物弓形蟲病預防的重組卡介苗，本發明還提供了該疫苗 的制備方法，屬于疫苗制備技術領域。
【背景技術】
[0002] 弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種世界范圍內廣泛分布的人獸共患病。其宿主 范圍非常廣，能夠感染人及大多數動物。弓形蟲感染對畜牧業生產危害嚴重，主要造成流 產、畸胎、死產等。弓形蟲的危害巨大，但對該病的防治至今尚未找到理想的藥物。盡管抗 寄生蟲藥物非常有效、廉價并且易于用藥，但弓形蟲耐藥性的產生以及人們普遍關注的藥 物殘留問題日益嚴重。相比而言，疫苗比較安全，無化學殘留且無污染。有學者通過對弓形 蟲抗原及免疫效應的深入研宄后認為有效的疫苗對該病的防治具有顯著的意義。弓形蟲疫 苗的研宄經歷了滅活疫苗、減毒活疫苗等多種探索，前者刺激機體產生的抗感染能力弱，后 者雖能較好地產生保護作用，但由于經突變后恢復毒力，故不適用。卡介苗（BCG)是全世界 應用最廣的預防結核病的疫苗，也是表達外源基因的活菌疫苗載體，它本身是一種免疫佐 劑和非特異免疫增強劑，能提高機體的免疫力。重組卡介苗（rBCG)集佐劑和載體于一身， 兼外源基因與活疫苗于一體，接種后可誘導機體產生特異性體液免疫和細胞免疫。多種病 毒、細菌、寄生蟲抗原以及細胞因子等蛋白，均可以在rBCG中表達。因此，采用基因工程方 法研發一種高效、廉價的新型動物弓形蟲病重組卡介苗是當務之急。
【發明內容】
[0003]本發明提供一種用于動物弓形蟲病預防的重組卡介苗，為穿梭表達載體用于動物 弓形蟲病預防的重組卡介苗和整合表達載體用于動物弓形蟲病預防的重組卡介苗。
[0004] 本發明還公開了用于動物弓形蟲病預防的重組卡介苗的制備方法，適用于工業化 生產。
[0005]本發明用于動物弓形蟲病預防的重組卡介苗的解決方案如下： 將獲得動物的細胞因子基因和剛地弓形蟲保護性抗原基因，進行TA克隆，測序鑒定正 確后將二者連接為組合體，然后再將二者組合體連接體與大腸桿菌_分枝桿菌穿梭表達載 體PMV261和整合表達載體pMV361相連，重組質粒轉化到BCG，經抗性和PCR篩選得到用于 動物弓形蟲病預防的重組卡介苗。
[0006]本發明所提供的用于動物弓形蟲病預防的重組卡介苗制備方法 本發明以剛地弓形蟲保護性抗原Rhomboid(Rho)基因和犬白介素2 (IL-2)基因為例， 進行穿梭表達載體和整合表達載體的構建，分別制成疫苗。
[0007] 、穿梭表達載體用于犬弓形蟲病預防的重組卡介苗疫苗的制備： 根據Genbank公布犬白介素2 (DIL-2)基因序列的開放閱讀框、剛地弓形蟲Rhomboid基因序列的開放閱讀框以及PMV261穿梭表達載體酶切位點設計引物分別對犬白介素2 (DIL-2)基因和剛地弓形蟲Rhomboid基因PCR，TA克隆。測序鑒定正確后進行雙酶切，切 膠回收，與進行同樣酶切的PMV261穿梭表達載體進行連接為pMV26l-DIL2-Rho，轉入DH5a中，將重組質粒pMV261-DIL2-Rho電穿孔轉化卡介苗中，37°C培養至對數生長期后，篩選 BCG重組子，PCR證實為陽性克隆后進行45°C熱誘導表達，對基因表達產物進行SDS-PAGE電 泳分析及Westernblotting鑒定，命名為rBCGpMV261_DIL2_Rho。
[0008] 疫苗免疫效果檢測：將制備好的穿梭表達載體用于犬弓形蟲病預防的重組卡介苗 rBCGpMV261-DIL2-Rho以106CFU/只的劑量通過皮下注射免疫途徑免疫寵物犬，并同時設 BCG組和空白對照組，三免二周后腹腔注射的方式接種弓形蟲RH株速殖子進行攻蟲試驗， 通過存活時間、存活率、體液免疫水平和細胞因子水平檢測等指標進行綜合評價。
[0009] 穿梭表達載體用于犬弓形蟲病重組卡介苗疫苗rBCGpMV261-DIL2-Rh0可對抗 一定劑量剛地弓形蟲對犬的攻擊，特異性抗體滴度隨免疫次數增加而逐漸升高，且差異極 顯著（P〈0.01) ;IL-2、IFN-y、TNF-a等細胞因子濃度均明顯升高，且與對照組相比差異 極顯著（P〈〇. 01);經腹腔接種弓形蟲1〇5個/只，犬存活時間與對照組相比均差異顯著 (P〈0. 05)〇
[0010] 、整合表達載體用犬弓形蟲病預防的重組卡介苗疫苗的制備： 根據犬白介素2 (DIL-2)基因序列的開放閱讀框、剛地弓形蟲Rhomboid基因序列的開 放閱讀框以及PMV361穿梭表達載體酶切位點設計引物分別對犬白介素2 (DIL-2)基因和 剛地弓形蟲Rhomboid基因PCR，TA克隆。測序鑒定正確后進行雙酶切，切膠回收，與進行同 樣酶切的PMV361穿梭表達載體進行連接為pMV361-DIL2-Rho,轉入DH5 a中，將重組質粒 pMV261-DIL2-Rho電穿孔轉化卡介苗中，37°C培養至對數生長期后，篩選BCG重組子，PCR證 實為陽性克隆后進行45°C熱誘導表達，對基因表達產物進行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting鑒定，命名為rBCGpMV361-DIL2-Rho。
[0011] 疫苗免疫效果檢測：將制備好的整合表達載體用于犬弓形蟲病預防的重組卡介苗 rBCGpMV361-DIL2-Rho以106CFU/只的劑量通過皮下注射免疫途徑免疫寵物犬，并同時設BCG組和空白對照組，三免二周后腹腔注射的方式接種弓形蟲RH株速殖子進行攻蟲試驗， 通過存活時間、存活率、體液免疫水平和細胞因子水平檢測等指標進行綜合評價。
[0012] 整合表達載體用于犬弓形蟲病預防重組卡介苗疫苗rBCGPmv361-DIL2-Rho可對 抗一定劑量剛地弓形蟲對犬的攻擊，特異性抗體滴度隨免疫次數增加而逐漸升高，且差異 極顯著（P〈〇. 01) ;IL_2、IFN-y、TNF-a等細胞因子濃度均明顯升高，且與對照組相比差 異極顯著（P〈〇. 01)。經腹腔接種弓形蟲1〇5個/只，犬存活時間與對照組相比均差異顯著 (P〈0. 05)〇
[0013]Rhomboid蛋白作為一類膜內絲氨酸蛋白酶，是參與EGF和EGFR信號轉導過程的 調節器。Rhomboid蛋白最先在果幡體內發現，近年來在許多原核和真核生物體內也發現 了該蛋白，在寄生蟲領域，惡性瘧原蟲、柔嫩艾美爾球蟲、微小隱孢子蟲、弓形蟲中均發現了 Rhomboid蛋白。最近的研宄已經確立了Rhomboid蛋白在頂器門原蟲侵入宿主細胞過程中 水解微線蛋白致使蟲體進入靶細胞的重要地位。研宄發現弓形蟲入侵宿主細胞的完整過程 需要粘附蛋白配體與宿主細胞受體之間的解聚作用，Rhomboid蛋白是一種新發現的絲氨酸 蛋白酶，在弓形蟲體內有分解黏附素的作用。因此本發明選擇使用Rhomboid基因作為保護 性抗原基因進行重組卡介苗的構建。IL-2又稱T細胞生長因子（Tcellgrowthfactor， TCGF)主要是有⑶4+和⑶8 +T淋巴細產生的一種糖蛋白。有研宄表明IL-2基因可以誘導 感染弓形蟲的鼠IFN-Y分泌增加，使小鼠的存活時間顯著延長。另有研宄表明IL-2基因 可以有明顯的增強Rhomboid蛋白的保護作用。因此本發明選擇使用Rhomboid基因作為保 護性抗原基因進行重組卡介苗的構建，并將白介素2 (DIL-2)插入到載體中以增加疫苗效 果。
[0014] 這樣的活載體疫苗既能發揮卡介苗本身較強的細胞免疫佐劑作用，又能使表達的 蛋白發揮免疫保護作用，達到更好的預防弓形蟲病的目的。因此這兩種疫苗的研制具有非 常廣闊的前景和應用價值。
[0015] 將本發明提供的兩種用于犬弓形蟲病預防的重組卡介苗通過皮下注射途徑免疫 犬，以腹腔注射的方式接種弓形蟲RH株速殖子進行攻蟲試驗，通過存活時間、存活率、體液 免疫水平和細胞因子水平檢測等指標進行綜合評價。結果顯示，用于犬弓形蟲病預防的重 組卡介苗rBCGpMV261-DIL2-Rho和rBCGpMV361-DIL2-Rho組均具有明顯的免疫促進作用， 各指標均強于陰性對照組，具有較好的抗剛地弓形蟲效果。
[0016] 本發明的積極效果在于： 利用重組卡介苗（rBCG)集佐劑和載體于一身，兼外源基因與活疫苗于一體，接種后可 誘導機體產生特異性體液免疫和細胞免疫，而且又能表達細胞因子和弓形蟲抗原蛋白，表 達的細胞因子能使表達的蛋白發更好的免疫保護作用，兩者優勢組合，達到更好的預防弓 形蟲病的目的。
[0017] 本發明疫苗熱穩定性好，運輸和保存較為容易，易于生產，產品不需純化，可直接 用于免疫保護試驗，免去了蛋白質后處理的復雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農 村。
【附圖說明】
[0018] 圖1為pMV261-IL2-Rho載體構建示意圖； 圖2為pMV(361)-IL2-Rho載體構建示意圖； 圖3為pMV261 (361)-IL2-Rho在卡介苗表達SDS-PAGE結果； 圖4為pMV2(