一種小豆蔻提取物及其抗腫瘤用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中藥領域，具體涉及一種小豆蔻提取物及含有該提取物的藥物制劑， 該小豆蔻提取物可以用來制備治療黑色素瘤的藥物。
【背景技術】
[0002] 植物小豆蔻為多年生草本。根莖粗壯，棕紅色。葉兩列，葉片狹長披針狀，葉鞘具 棕黃色柔毛。穗狀花序由莖基部抽出。花序顯著伸長，花排列稀疏，花冠白色。果實長卵圓 形，果皮質韌，不易開裂。種子團分3瓣，每瓣種子5~9枚，種子氣味芳香而峻烈。主產越 南、斯里蘭卡和印度南部的馬拉巴（Malabar)海岸。實成熟時收采，除去殘留的果柄，曬干。 使用部分為姜科植物小豆蔻的干燥果實。
[0003] 藥材小豆蔻為姜科植物小豆蔻Elettaria cardamomum(L. )Maton的干燥近成熟果 實，是藏醫與維吾爾醫用藥，以"加素"之名始載于《四部醫典》，現被多國藥典收載。小豆蔻 是世界著名的植物藥與香料，被稱為"香料之后"，原產于印度南部、斯里蘭卡及瓜地馬拉等 地，在印度傳統醫學中使用歷史超過兩千年，具有祛風、健胃的功效。目前中醫很少使用，小 豆蔻曾以"豆蔻"之名收載于1953年版中國藥典。
[0004] 小豆蔻已報道的成分主要為揮發油，以及多糖與蛋白質，推測還含有黃酮類化合 物，但目前尚未見黃酮類成分單體的分離與鑒定。揮發油是小豆蔻中重要的活性成分，含量 高達7%，超聲提取得到的揮發油以a-乙酸松油脂、桉油精、芳樟醇、a-松油醇、乙酸芳 樟酯為主，與超臨界C0 2提取所得成分類似；如以正己烷提取，揮發油組分有所不同，為檸檬 烯、桉油精、萜品油烯、月桂烯。此外，還含有麝香草醇、橙花基醋酸酯、蒎烯、橙花叔醇、香檜 烯等。
[0005] 小豆蔻藥理活性多樣，尤以抗腫瘤活性報道最多，涉及皮膚、肺、結腸等多個部位 的腫瘤，對胃腸道也有較好的保護作用，此外，還具有抗菌、抗氧化、抗炎、鎮痛等作用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種小豆蔻提取物，該提取物的制備方法和液相分析方 法，含有該提取物的藥物制劑及利用該提取物制備治療黑色素瘤藥物的用途。
[0007] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0008] 一種小豆蔻提取物，該提取物由以下方法制備：
[0009] 步驟一：小豆蔻藥材粉碎，水蒸汽蒸透，烘干；
[0010] 步驟二：用75%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味得到濃縮液；
[0011] 步驟三：對步驟二濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得 到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
[0012] 步驟四：正丁醇萃取物用AB-8大孔樹脂富集，先用10%乙醇沖洗8個柱體積除去 多糖，再用65%乙醇洗脫6個柱體積，收集65%洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥。
[0013] 進一步地，步驟一中蒸制方法為：高壓滅菌鍋105°C蒸制2小時。
[0014] 為了能夠通過建立HPLC指紋圖譜的方法控制不同產地、批次藥材制備的小豆蔻 提取物批間差異，所述提取物的液相分析方法為：
[0015] 色譜柱：DiamonsilC18 柱（4. 6mmX 250mm，5 y m);
[0016] 流動相：A為乙腈，B為0. 1 %磷酸溶液（三乙胺調節pH值至6. 5);
[0017] 梯度洗脫程序：0? 01 ~70min，A 20% - 80% ;
[0018] 流動相流速：1. OmL ? mirT1;
[0019] 檢測波長：240nm ;柱溫：30°C ;
[0020] 進樣量：10 yL。
[0021] 藥物制劑，含有治療有效量的所述小豆蔻提取物和藥學上可接受的載體。
[0022] 所述的小豆蔻提取物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應用。
[0023] 所述的藥物制劑在制備治療黑色素瘤的藥物中的應用。
[0024] 本發明提取物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物制劑的形式使用。
[0025] 所述藥物制劑含有治療有效量的本發明小豆蔻提取物，其余為藥物學上可接受 的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0026] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發明的藥物制劑以單位體重服用量的形式使用。本發明提取物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質體或乳劑等。
[0027] 本發明的優點：本發明通過對小豆蔻藥材蒸制處理，生成更多小極性的化合物，增 強細胞膜通透性，具有抑制黑色素瘤細胞的作用；本發明提供的液相分析方法可以用于建 立該提取物的指紋圖譜，用于控制不同產地、批次藥材制備的提取物的批間差異。
【附圖說明】
[0028] 圖1為小豆蔻提取物HPLC液相圖譜。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0030] 主要試劑和材料：小豆蔻藥材購自安徽毫州中藥材市場；食品級乙醇購自上海凌 峰化學試劑有限公司；醫藥級AB-8大孔樹脂購自天津波鴻樹脂有限公司；乙腈為HPLC級， 購于TEDIA ;85%磷酸為HPLC級，購于TEDIA ;色譜用純凈水為哇哈哈純凈水。人A375黑色 素瘤細胞株由第三軍醫大學贈。DMEM培養基、0. 25%胰酶購自美國Gibco公司；MTT(3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍、DMS0 (二甲基亞砜）、BrdU 購自美國Sigma公司；鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司；山羊抗鼠二抗購自美國 Cell signaling公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Promega公司。
[0031] 恒溫C02培養箱，普通冰箱，-80°C冰箱均為美國Forma公司；超凈工作臺購自 中國蘇州凈化工程公司；倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡購自Olympus公司；電熱恒溫培養 箱購自中國上海躍進醫療器械廠；自動酶標儀購自日本Wako公司；紫外分光光度儀購自 美國Beckman公司；J6-HC高速離心機購自美國Beckman公司；低溫微量離心機購自德國 Eppendorf公司；振蕩搖床購自美國Forma公司。
[0032] 實施例1 :小蓮提取物制備
[0033] 取小豆蔻藥材5kg粉碎，用紗布包裹，置于高壓滅菌鍋中蒸制2小時，溫度105°C， 取出置烘干箱中烘干；烘干藥材用75%乙醇熱回流提取三次，每次提取2小時，每次用75% 乙醇15L，合并提取液，濃縮至無醇味（3L);濃縮液依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯 (3LX3次）和水飽和的正丁醇（3LX3次）萃取，分別得到石油H萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔樹脂富集，先用10%乙醇沖洗8個柱體積出去 多糖，再用65%乙醇洗脫6個柱體積，收集65 %洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥（545g)。
[0034] 實施例2 :液相色譜分析
[0035] 供試品溶液配制：取實施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加 30mL 20%乙腈水溶液超聲溶解，冷卻至室溫后，繼續加20%乙腈水溶液定容。
[0036] 分析方法：
[0037] 高效液相色譜儀：Agilent 1260,二元泵；
[0038] 色譜柱：Diamonsil C18 柱（4. 6mmX 250mm，5ym);
[0039] 流動相：A為乙腈，B為0? 1 %磷酸溶液（三乙胺調節pH值至6. 5);
[0040] 梯度洗脫程序：0? 01 ~70min，A 20% - 80% ;
[0041] 流動相流速：1. OmL ? mirT1;
[0042] 檢測波長：240nm ;柱溫：30°C ;
[0043] 進樣量：10 yL。
[0044] 對用10批不同產地、批次小豆蔻制備的提取物進行分析，建立指紋圖譜進行匹 配，結果1~9號峰在10批樣品色譜圖中均出現。因此標定9個峰為共有指紋峰，據此建 立該提取物的HPLC指紋圖譜，結果見圖1。
[0045] 實施例3 :小豆蔻提取物藥理試驗
[0046] -、試驗方法
[0047] 1、細胞培養
[0048] 1. 1細胞復蘇
[0049] 將凍存在液氮罐中的A375黑色素瘤細胞取出，迅速放入37°C的溫水中，輕輕搖動 使其盡快融化（大約lmin)。然后吸出細胞懸液，加入到已加有2mL培養基的離心管中，輕 輕吹打混勻，800r/min，離心5min，棄去上層培養基。用含有10 % FBS和1 %的青霉G/鏈霉 素的DMEM培養基8mL制成細胞懸液后，接種至10cm培養盤中。然后置于5% C02、37°C恒 溫培養箱中進行培養。
[0050] 1. 2細胞傳代
[0051] 顯微鏡下觀察細胞融合度達80% -90%時即可進行傳代。先用2mLPBS洗滌細胞2 次，然后加入0. 25 %的胰酶lmL。輕輕水平搖動培養盤，使消化液能覆蓋細胞的表面，然后 置于37°C溫箱中消化約lmin。置于顯微鏡下見細胞變圓回縮，然后迅速加入lmL含有FBS 的培養基終止消化。輕輕吹打至細胞分散均勻，然后根據細胞密度按照1 : 2或1 : 3傳 代，重新接種于新的培養盤，于5% C02、37°C恒溫培