可控釋放血管內皮生長因子的去細胞瓣膜及其制法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥和生物材料領域，主要涉及新型去細胞瓣膜的技術領域，具體涉及可控釋放血管內皮生長因子的去細胞瓣膜及其制法和應用。
【背景技術】
[0002]心臟瓣膜病是一種嚴重危害人類健康的世界性公共問題，發病率約2.5%。心臟瓣膜置換是治療瓣膜病的有效方法，到2050年，需行瓣膜置換手術病人估計將會超過85萬。臨床上常用的心臟瓣膜替換物多為機械瓣膜與生物瓣膜，但它們均有嚴重缺陷。機械瓣膜的血流流場紊亂常導致血液有形成分破壞，可能發生與凝血系統有關的出血及血栓形成的并發癥，術后需終生服用抗凝藥物治療。生物瓣膜大多為經戊二醛交聯的豬心臟瓣膜或牛心包瓣，但因細胞毒性、鈣化位點暴露、缺少內皮細胞屏障等，瓣膜組織會發生退行性變、鈣化，最終導致瓣膜裂解、衰壞而至功能障礙，使患者約10-15年后面臨再次手術的可能，且以上兩種瓣膜均無法隨患者生長而重構。因此進一步改進或研制一種能夠克服上述缺陷的理想瓣膜替代物成為心臟外科醫生的追求目標。
[0003]組織工程心臟瓣膜是一種新穎的瓣膜假體，利用組織工程技術將種子細胞種植于支架材料上，并于特定的條件下構建組織工程心臟瓣膜，使之在植入體內替換病變瓣膜后仍然具有生長、重建、修復能力，術后無需抗凝治療，其生物學性能、機械性能與正常瓣膜相當。支架材料主要有去細胞的生物基質和合成的高分子聚合物。
[0004]去細胞基質由于其良好的生物相容性，并可為種子細胞黏附、增殖、分化等提供類似于體內的基質微環境，在組織工程學中得以廣泛應用。目前去細胞基質支架材料多為豬心臟瓣膜和牛心包，但去細胞基質表面無完整的內皮細胞覆蓋，不能控制血漿成分的滲入，可能是引起組織鈣化和衰敗的先行條件。另外，由于去細胞基質表面膠原纖維的暴露，在體內可能激活血小板而導致血栓的形成。最終，手術置換的瓣膜會裂解、衰壞而至功能障礙和產生一系列與血栓相關的并發癥，所以去細胞基質的內皮化非常重要。
[0005]血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)具有促進內皮細胞增殖、生長、移行的功能，常用來修飾生物材料，使生物材料功能化。其與細胞膜上特異性受體結合，通過VEGF/VEGFR-2信號通路促進細胞的增殖和材料內皮化、血管形成等。其中VEGF 165在各種細胞中分泌最多，也是VEGF發揮作用的主要形式。血管內皮祖細胞表面高表達VEGFR-2，可與VEGF165特異性結合，利于促進血管內皮祖細胞動員、迀移和在局部的定植、生長、分化。
[0006]納米載藥控釋系統可作為一種新穎的藥物載體，能夠攜帶多種藥物且能夠通過改變納米材料的分子量和投料量嚴格控制藥物的釋放速度和釋放周期，在局部可達到預定的藥物濃度，從而提高藥物的生物利用度。納米載藥控釋系統以合適的方法將蛋白類藥物包封后，既不影響蛋白活性，又能對其有效地保護，使其避免體內蛋白酶的降解而過快清除。
[0007]聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈段以重復乙二醇氧化乙稀為基礎結構，具有高度親水性、無毒、無抗原性和免疫原性及良好組織相容性等優點。聚己內酯(polycaprolactone,PCL)具有優良的藥物透過性、優異的生物可降解性和生物相容性。PEG與疏水性PCL鏈段結合后的PEG-PCL共聚物，與PCL —樣，均可作為優良的藥物運輸骨架材料，在醫藥、食品等領域得到廣泛應用。PCL和PEG均已被美國FDA組織批準在人體內使用，且PEG-PCL經國際認證無毒害，無免疫原性，具有良好的生物降解性和相容性。
【發明內容】
[0008]本發明解決的技術問題是:去細胞基質表面如果沒有被內皮細胞完整覆蓋，將不能控制血漿成分的滲入，可能會引起瓣膜組織的鈣化和激活血小板，但目前去細胞基質的內皮化技術還不成熟，其內皮化速度和效果還有待提高，瓣膜支架材料的相關生物學性能還有待改善。
[0009]本發明的目的在于提供一種可控釋放血管內皮生長因子的新型去細胞瓣膜的制備方法。借鑒納米載藥控釋系統原理，利用MAL-PEG-PCL共聚物修飾的PCL納米粒包封生物信號分子VEGF165，形成可控釋放的載VEGF165的PCL納米粒，再通過MAL-PEG末端馬來酰亞胺中不飽和的碳碳雙鍵與引入到去細胞瓣膠原蛋白上的巰基發生邁克爾加成反應，從而制備可控釋放VEGF165功能的去細胞瓣膜。該納米載體以合適的方法將VEGF165包封后，既不影響生物信號分子活性，又能對其有效地保護，使其免遭化學和酶降解以及體內高速血流剪切力的破壞，最終保持生物信號分子的生物活性。通過調整PCL的分子量和投料量控制VEGF165的釋放速度和釋放周期，從而使去細胞瓣處維持一定濃度的VEGF165。
[0010]去細胞瓣膜上的VEGF165對內皮祖細胞具有強烈的招募作用，使內皮祖細胞在去細胞瓣膜局部定植、生長、分化，最終實現去細胞基質支架材料的內皮化，使去細胞基質與血漿成分相隔開，從而防止鈣化位點和膠原纖維的暴露，進而防止或延緩瓣膜支架材料的鈣化和血小板的激活。將納米載藥控釋系統應用于組織工程，制備了可控釋放VEGF165的新型去細胞瓣膜，為組織工程心臟瓣膜的改性修飾研宄提供一種新方法。
[0011]具體來說，針對現有技術的不足，本發明提供了如下技術方案:
[0012]本發明提供一種可控釋放血管內皮生長因子的納米材料，其特征在于，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯，聚己內酯和血管內皮生長因子。
[0013]優選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺一聚乙二醇-聚己內酯4-10重量份，聚己內酯20-40重量份，和血管內皮生長因子0.001-0.01 重量份。
[0014]優選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯4-6重量份，聚己內酯20-30重量份，和血管內皮生長因子0.001-0.005 重量份。
[0015]優選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯，聚己內酯，磷脂和血管內皮生長因子。
[0016]優選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺一聚乙二醇-聚己內酯4-10重量份，優選為4-6重量份，聚己內酯20-40重量份，優選為20-30重量份，磷脂5-10重量份，優選為5-8重量份，和血管內皮生長因子0.001-0.01重量份，優選為0.001-0.005重量份。
[0017]優選的，上述納米材料中，所述血管內皮生長因子包含VEGF165。
[0018]優選的，上述納米材料中，所述血管內皮生長因子占所述納米材料的質量分數為0.003 % -0.04 %，優選為 0.03 % -0.02 %。
[0019]優選的，上述納米材料中，所述納米材料中血管內皮生長因子的包封率為75% -85%。
[0020]優選的，上述納米材料中，所述納米材料的平均粒徑為80-220nm。
[0021]優選的，上述納米材料中，所述納米材料中血管內皮生長因子在48h的釋放率為50-60%。
[0022]優選的，上述納米材料中，所述納米材料通過包含下述步驟的方法制備得到:
[0023]將血管內皮生長因子、聚己內酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0024]優選的，上述納米材料中，所述納米材料通過包含下述步驟的方法制備得到:
[0025](I)將所述血管內皮生長因子和磷脂混合反應得到血管內皮生長因子-磷脂復合物；
[0026](2)將血管內皮生長因子-磷脂復合物、聚己內酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0027]優選的，上述納米材料中，所述超聲處理后還包括下述步驟:
[0028]將步驟超聲處理后所得水包油乳劑中所述有機溶劑揮發，得到所述納米材料。
[0029]優選的，上述納米材料中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，優選為二氯甲烷。所述水溶性聚合物選自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮或乙烯-乙烯醇共聚物，優選為聚乙烯醇。
[0030]優選的，上述納米材料中，所述血管內皮生長因子和磷脂的重量比為1:1000?1:5000ο
[0031]優選的，上述納米材料中，所述油相與水相的體積比為1:6?1:8。
[0032]優選的，上述納米材料中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯采用包含下述組分的原料制成:馬來酰亞胺_聚乙二醇1-5重量份，和ε -己內醋0.4-2重量份。
[0033]優選的，上述納米材料中，馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯采用包含下述組分的原料制成:馬來酰亞胺_聚乙二醇1-2重量份，和ε -己內醋0.4-1.5重量份。
[0034]優選的，上述納米材料中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯的平均分子量為4000-7000 ο
[0035]優選的，上述納米材料中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯通過包括下述步驟的方法制備得到:
[0036](I)將馬來酰亞胺-聚乙二醇、ε -己內酯和催化劑混合，在65-70°C溫度下發生開環聚合，合成馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯初產物；
[0037](2)將步驟(I)所述初產物溶解于有機溶劑中，加入沉淀劑使其沉淀，得到所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯。
[0038]優選的，上述納米材料中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，優選為二氯甲烷。所述沉淀劑選自乙醚、甲醇、正己烷或環己烷中的一種或兩種以上，優選為乙醚或甲醇的一種或兩種。
[0039]優選的，上述納米材料中，所述血管內皮生長因子-磷脂復合物通過包括下述步驟的方法制備得到:
[0040]將磷脂加入叔丁醇中，配制成磷脂/叔丁醇溶液，將磷脂/叔丁醇溶液與血管內皮生長因子水溶液混合，在-50?_60°C條件下冷凍，得到所述血管內皮生長因子-磷脂復合物。
[0041]優選的，上述磷脂/叔丁醇溶液的濃度為5-10mg/ml，所述血管內皮生長因子水溶液的濃度為1-10 μ g/ml，優選為1-5 μ g/mlo
[0042]本發明還提供一種可控釋放血管內皮生長因子的去細胞瓣膜，其特征在于，包括巰基化的去細胞瓣膜和連接于所述巰基化的去細胞瓣膜上的上述任一種納米材料。
[0043]優選的，上述可控釋放血管內皮生長因子的去細胞瓣膜，其通過包括下述步驟的方法制備得到:
[0044](I)去細胞瓣膜和巰基化試劑N-丁二酸-S-乙酰基巰基乙二醇酯發生巰基化反應后，用鹽酸羥胺對所生成的乙酰化巰基進行保護，得到巰基化的去細胞瓣膜；
[0045](2)將步驟(I)所述巰基化的去細胞瓣膜與上述任一納米材料混合，反應后得到所述可控釋放血管內皮生長因子的去細胞瓣膜。
[0046]本發明還提供上述任一種納米材料的制備方法，包括下述步驟:
[0047]將血管內皮生長因子、聚己內酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0048]優選的，上述制備方法中，包括下述步驟:
[0049](I)將所述血管內皮生長因子和磷脂混合反應得到血管內皮生長因子-磷脂復合物；
[0050](2)將血管內皮生長因子-磷脂復合物、聚己內酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0051]優選的，上述制備方法中，還包括下述步驟:
[0052]將超聲處理后所得水包油乳劑中所述有機溶劑揮發，得到所述納米材料。
[0053]優選的，上述制備方法中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，優選為二氯甲烷。所述水溶性聚合物選自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纖維素、甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素，優選為聚乙烯醇。
[0054]優選的，上述制備方法中，還包括下述步驟:
[0055]加入聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破壞未包封的血管內皮生長因子-磷脂復合物。
[0056]優選的，上述制備方法其中，所述血管內皮生長因子和磷脂的重量比為1:1000?1:5000ο
[0057]優選的，上述制備方法中，所述油相與水相的體積比為