超聲前體的制備方法
【專利說明】超聲前體的制備方法 發明領域
[0001] 本發明涉及制備包含磷脂穩定的全氟丁烷微泡的超聲造影劑前體的方法。所述方 法順從工業規模生產，并且提供所述微泡的更一致的瓶與瓶產率（Vial-to-vial yield)和 尺寸分布。還提供使用本發明的方法制備試劑盒和超聲造影劑的方法。
【背景技術】
[0002] 基于全氟化碳（例如，全氟丙烷或全氟丁烷）的磷脂穩定的微泡的超聲造影劑在 本領域中熟知[參見，例如 Wheatley 等，J. Drug Del. Sci. Technol.，23(1)，57-72 (2013)]。
[0003] WO 97/29782教導了在室溫下穩定的超聲造影劑前體可通過在選自蔗糖、麥芽糖、 海藻糖、棉子糖或水蘇糖（優選蔗糖）的冷凍-干燥穩定劑存在下凍干全氟化碳微泡來制 備。
[0004] W0 99/03558公開了選擇超聲造影氣體微泡形成多分散混合物以獲得具有緊湊尺 寸分布（即，單分散性）的這類微泡的方法。所述方法包括浮選和再懸浮。
[0005] W0 99/08715公開了制備包含含氣體囊泡的水性分散體的藥物組合物的方法，所 述囊泡的膜包含兩親性成膜材料，所述方法包括： (i) 由包含兩親性成膜材料的混合物產生含氣體囊泡的液體分散體； (ii) 凍干所述含氣體囊泡的液體分散體； (iii) 用無菌水性液體重構步驟（ii)的凍干產物以生成含氣體囊泡的水性分散體； 和 (iv) 處理步驟（i)或步驟（iii)的水性分散體產物或步驟（ii)的凍干產物以生成含 氣體囊泡的基本無聚集物的無菌水性分散體。
[0006] W0 99/08715教導了在步驟⑴和步驟（ii)之間的時間應該減至最少，以抑制微 泡團聚形成不想要的較大物質。然而，W0 99/08715沒有教導在凍干之前應該對含氣體囊 泡進行尺寸控制，以及在凍干步驟或在批量生產過程中分配到多個單個小瓶中之前必須使 用防凍劑/凍干保護劑。
[0007] EP 1228770 A1教導了制備包含氣體微泡的凍干的超聲造影劑的方法，其中凍干 的前體的小瓶在減小的頂空氣體壓力下密封。據說該減壓有助于控制在重構前體小瓶后形 成的水性微泡組合物中的粒度。
[0008] W0 2004/069284解決了得到具有限定尺寸分布的磷脂穩定的氣體微泡超聲造影 劑的問題。W0 2004/069284教導了在凍干之前在微泡制備乳液中應該使用與水基本不混溶 的有機溶劑。W0 2004/069284教導了在重構凍干的前體后得到的微泡具有相對較小的直徑 和窄尺寸分布。
[0009]Solis等[Int. J. Pharmaceut.，396(1-2)，30-38 (2010)]研宄了賦形劑（包括凍 干保護劑）對凍干的全氟丙烷微泡前體的影響。他們得到的結論是，葡萄糖是最好的凍干 保護劑，緊接著是海藻糖，這兩者均優于蔗糖或甘露糖醇。
[0010] Feshitan 等[J. Coll. Interf. Sci.，329，316-324 (2009)]報道，與表面活性劑 涂覆的微泡形成對比，脂質涂覆的微泡在離心之后穩定，并且脂質殼粘性高且相對不透氣。 Feshitan等報道在4-5 y m尺寸范圍內的全氟丁烷微泡穩定至少2天，但在2周后趨于崩解 成較小尺寸的微泡（1-2 ym)。
[0011] 仍然需要能夠控制造影劑的微泡濃度和尺寸分布、產率和其它重要特性的瓶與瓶 變化的超聲凍干前體制備方法。所述方法需要順從工業規模生產，并獲得具有滿足規章要 求（例如，美國藥典和國際協調會議指南（ICH Guidelines))的小瓶含量和安全性特性的 均一性的前體產物。
【發明內容】
[0012] 發明概述 例如超聲處理和高剪切乳化的常規微泡超聲造影劑制備方法提供良好的產率和低成 本生產。當容量規模擴大到工業生產時，它們具有難以控制微泡的尺寸分布的缺點。雖然 已經開發了容許制備具有緊湊尺寸分布的這類微泡的其它制備技術，但這些備選方法的產 率較低，涉及高成本設備或太慢而無法擴大規模到工業生產方法。
[0013] 本發明尋求提供順從工業規模生產、但對造影劑的微泡濃度、尺寸分布、產率和其 它重要特性的瓶與瓶變化也給予足夠控制的方法。
[0014] 本發明人發現，在上千個微泡造影劑小瓶的批量生產中，兩個關鍵參數對于控制 變化性是重要的：（a)在凍干之前的微泡的尺寸范圍；和（b)在分配到指定小瓶與將小瓶 內含物在-40°C至-70°C下冷凍之間經過的時間（"停留時間（holding time)"）。
[0015] 本發明提供了控制這兩參數的方法，隨之而來的優勢是： (i) 在每個小瓶中最佳微泡產率和濃度； (ii) 對瓶與瓶含量的均一性的控制。
[0016] 還發現本發明的造影劑前體對多價陽離子不太敏感。
[0017] 不希望受理論約束，本發明人認為，由于在液體基質（例如，蔗糖溶液）和充氣微 泡之間的高密度增量，微泡趨于快速分離到液體體積的頂部（"乳脂化（creaming)"）。必 須使該乳脂化減至最小并對其加以控制，從而提供上述益處（i)和（ii)。認為很可能表面 層中高濃度的微泡在凍干期間削弱了餅的干燥，和/或太高的局部濃度減少了微泡的生存 率，因為它們被部分地捕集在最終蔗糖結構的外側，即表面中的孔，而不是完全包埋在氣囊 (gas pocket)中。
[0018] 發明詳述 在第一方面，本發明提供了制備包含由氫化卵磷脂酰絲氨酸穩定的全氟丁烷微泡在蔗 糖中的凍干組合物的超聲造影劑前體的方法，其中所述方法包括： (i) 提供所述由氫化卵磷脂酰絲氨酸穩定的全氟丁烷微泡在水性溶液中的水性懸浮 液； (ii) 將所述微泡的尺寸調節到在2-5Mm范圍內的中值尺寸； (iii) 用無菌水性蔗糖溶液稀釋來自步驟（ii)的調好尺寸的懸浮液以獲得5-20% w/ v的最終蔗糖濃度； (iv) 將來自步驟（iii)的組合物的等分試樣分配到小瓶中以獲得填充的小瓶； (V)在完成步驟（iv)的分配之后在小于5分鐘的停留時間段內，將各個這樣填充的小 瓶冷卻到-40 °C至-70 °C的溫度； (vi) 根據需要重復步驟（iv)和（V)，直到已得到所需數目的冷卻的填充的小瓶； (vii) 冷凍干燥來自步驟（v)和（vi)的冷卻的填充的小瓶； (viii) 用全氟丁烷回填在來自步驟（vii)的冷凍干燥的小瓶中的頂空氣體； (ix) 用封蓋件密封來自步驟（viii)的小瓶。
[0019] 術語"造影劑"具有其在體內醫學成像領域中的常規含義，并且是指以適合哺乳動 物施用的形式的試劑，與通過僅使哺乳動物受試者成像得到的圖像相比，其有助于提供在 目標區域或器官中的更清晰的圖像。術語"受試者"是指哺乳動物體內，優選完整哺乳動物 體內，且更優選活著的人類受試者。短語"以適合哺乳動物施用的形式"意指如下組合物， 其無菌，無熱原，沒有產生毒性或副作用的化合物并且在生物相容的pH(約pH 4.0-10. 5) 下配制。所述組合物沒有會導致體內栓塞的危險的微粒，并配制成在與生物流體（例如，血 液）接觸時不會發生沉淀。所述組合物還僅含有生物相容性賦形劑，且優選為等滲的。
[0020] 正如其它體內成像劑，造影劑設計成對欲成像的哺乳動物受試者具有最小的藥理 學影響。優選造影劑可以侵襲性最低的方式，即在專業醫療專家實施時對哺乳動物受試者 沒有明顯健康危險的情況下，對哺乳動物身體施用。這種侵襲性最低的施用優選靜脈內施 用到所述受試者的周邊靜脈，而不需要局部或全身性麻醉。
[0021] 術語"微泡"具有其在體內超聲成像領域中的常規含義，并且是指通常在0.5 ym 和10 ym之間的直徑的氣體微泡。在高于7 ym的尺寸下，存在在肺毛細管中明顯的滯留 危險（栓塞）。所述微泡的尺寸與紅血細胞類似，這允許它們在遍及哺乳動物身體的微血 管和毛細管中顯示出類似的特征[Sirsi等，Bubble Sci.Eng.Technol.，1(1-2)，3-17 (2009)]〇
[0022] 本發明的合適微泡如Sirsi等（上文）描述由磷脂殼或涂層、尤其是在氫化卵磷 脂酰絲氨酸（H-EPS)中存在的磷脂穩定。在H-EPS中存在的磷脂主要是磷脂酰絲氨酸和磷 脂酸[Hvattum 等，J. Pharm. Biomed. Anal.，42，506-512 (2006) ] 〇
[0023] 全氟丁烷（"PFB"）具有其標準化學含義，并且在醫學用途的情況下也稱為全氟丁 烷（perflubutane)。全氟正丁烷的化學式為CF 3CF2CF2CF^ C 4F1Q，沸點為-2. 2°C。商品全 氟正丁烷含有少量（通常2-4%)的全氟異丁烷異構體，即CF3CF (CF3) CF3。
[0024] 術語"水性懸浮液"是指微泡在水性溶劑中的懸浮液，該水性溶劑包括水和/或與 水混溶的溶劑。該水性溶劑優選為生物相容性載體。術語"生物相容性載體"是指使組