透明質酸修飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納米劑的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥，特別是一種透明質酸（HA)修飾單壁碳納米管（SWCNTs)制備診 斷治療的還原敏感性藥物納米劑的方法及應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康和生命安全，它的治療成為人們關注的焦點，據 我國流行病學調查表明，無論是城市還是鄉村，惡性腫瘤死亡率均位居全部死亡疾病之首。 鹽酸阿霉素（Doxorubicin，D0X)作為廣譜抗腫瘤化療藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都 有殺滅作用，臨床主要用于治療乳腺癌、前列腺癌、肉瘤等淺表實體瘤。目前鹽酸阿霉素上 市劑型為注射劑，在臨床使用時由于缺乏靶向性對造血系統和心臟所造成的毒性較大。
[0003] 碳納米管是由石墨卷曲而形成的圓柱體，內徑從1納米到十幾納米，外徑也在幾 個納米到十幾納米之間，長度一般都在納米級或者微米級。據報道碳納米管毒性取決于其 表面的功能化，具有高度功能化的碳納米管通常具有較小毒性。而未經任何親水基團修飾 的單壁碳納米管（SWCNTs)，由于其表面的高度疏水性，導致在細胞培養過程中與細胞發生 相互作用，包括與細胞內蛋白質、核酸等物質聚合，從而產生一定的細胞毒性。透明質酸 (hyaluronic acid，HA)是一種自然界中存在的線性多糖，具有高生物相容性，生物可降解 性，在體內通過淋巴系統被清除，低毒性等優點，HA被廣泛的應用于生物醫藥領域中。另外 研宄發現HA受體與腫瘤相關，多種腫瘤過表達透明質酸受體CD44,雖然正常細胞也有CD44 受體，但正常組織的⑶44處于沉默狀態，并未被激活。
[0004] 到目前為止，臨床上常用的磁共振造影劑多缺乏靶向性、半衰期較短、弛豫效能低 且大量使用時可導致毒副作用等缺點，因此發明一種靶向性、半衰期長、弛豫效能高且毒性 低的磁共振造影劑是亟待解決的技術問題。
【發明內容】
[0005] 針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種透明質酸修 飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納米劑的方法及應用，可有效解決抗癌藥 物阿霉素的腫瘤靶向性差、毒副作用大和靶向性差、弛豫效能低、半衰期短的問題
[0006] 本發明解決的技術方案是，該傳遞體系由透明質酸（HA)修飾后的單壁碳納米管 (SWCNTs)通過3, 3' -二硫代二丙酸作為連接臂和阿霉素相連，然后將三氯化釓吸附到單 壁碳納米管上，再用表面活性劑分散形成用透明質酸修飾的單壁碳納米管，用于診斷治療 的還原敏感性藥物的納米制劑；所述透明質酸為分子量大于等于600道爾頓且小于等于 400kd的低分子量透明質酸；所述單壁碳納米管的長度為1~3 ym、直徑為1~2nm ;所述 連接臂為碳原子數2~12的3, 3' -二硫代二丙酸或辛二酸；所述3, 3' -二硫代二丙酸中 的二硫鍵具有還原敏感性，在腫瘤細胞高濃度的谷胱甘肽作用下迅速斷裂釋放藥物。其制 備方法由以下步驟實現：
[0007] (1)羧化碳管（即羧基化碳納米管）與氨化透明質酸連接（HA-SWCNTs):
[0008] 稱取25~75mg羧化碳管于15~45ml反應溶劑的燒杯中，冰浴探超15~45min， 成羧化碳管溶液；稱取氨化透明質酸（HA-NH 2)60~120mg溶于5-15ml的溶劑中，成氨化透 明質酸溶液；稱取EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺）120~240mg、NHS (羥基 琥珀酰亞胺）80~160mg，用1~7ml溶劑渦旋溶解，加入到羧化碳管溶液中，攪拌室溫反應 5~25min，成羧化碳管混合溶液；在氨化透明質酸溶液中加入三乙胺100~260 y 1，然后 將氨化透明質酸和三乙胺的混合溶液快速滴加至羧化碳管混合溶液中，室溫反應8~40h， 加入3~4倍體積預冷的丙酮，冷卻析晶，過濾，丙酮洗滌沉淀，得沉淀物，沉淀物用水復溶， 透析2d，凍干；
[0009] 所述的溶劑為水、甲酰胺、或N，N_二甲基甲酰胺與水、或甲酰胺與水、或N，N_二甲 基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑，或其它類似溶劑以及其它類似溶劑的混合物；
[0010] 所述的氨化透明質酸是，將透明質酸95-105mg、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基） 碳二亞胺鹽酸鹽254-264mg和N-羥基琥珀酰亞胺150-160mg，溶解在8-12ml的有機溶劑 中，室溫攪拌30min，得反應液，將反應液緩慢滴入0. 4-0. 6ml乙二胺的甲酰胺溶液中，冰浴 滴加lh，升至室溫反應6-48h，加入50ml丙酮沉淀，抽濾，得沉淀物，沉淀物加水復溶，透析 2d，冷凍干燥，即得氨化透明質酸，有機溶劑為甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜的一 種；
[0011] (2)制備 SWCNTs-HA-ss-COOH (即 HA 修飾的 SWCNTs 負載 3, 3' -二硫代二丙酸）：
[0012] 取500~1500mg碳原子數2~12的3, 3'-二硫代二丙酸或辛二酸為連接臂，溶解 于反應溶劑中，EDC 500~1500mg、NHS 200~lOOOmg分別渦旋溶解于反應溶劑中，將上述 溶液混合攪拌活化5~25min，成活化溶液；將HA-SWCNTs 50~350mg超聲溶解，與活化溶 液混合，室溫條件下攪拌1~8h，所得產物通過丙酮冰浴析晶，過濾，收集沉淀，沉淀用水復 溶，透析2d，除去多余的3, 3' -二硫代二丙酸、EDC、NHS鹽，凍干，成SWCNTs-HA-ss-C00H(HA 修飾的SWCNTs負載3, 3' -二硫代二丙酸），4°C保存；
[0013] 所述的反應溶劑為水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與水、或甲酰胺與水、或 N，N-二甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑，或其它類似溶劑以及其它類似溶劑的混合物；
[0014] (3) SWCNTs-HA-ss-COOH 與 D0X (阿霉素）的連接成 SWCNTs-HA-ss-DOX :
[0015] 取1~8mg D0X .HCL溶解于500~1500 y 1的pH為7~10的PBS溶液中，成第 一溶液；稱取2~15mg的SWCNTs-HA-ss-COOH超聲溶解于200~800 y 1反應溶劑，成第二 溶液，將兩種溶液混合在一起反應1~4h，成混合液；取10~60mg鹽酸羥胺溶解于200~ 2000 y 1的pH為7~10的PBS溶液中，加入混合液中反應0. 5~5h，得產物，產物用超純 水透析2d后，凍干，成SWCNTs-HA-ss-DOX ;
[0016] 所述的反應溶劑為二氯亞砜、或N，N-二甲基甲酰胺、或二氯亞砜與N，N-二甲基甲 酰胺的混合溶劑，或其它類似溶劑以及其它類似溶劑的混合物；
[0017] (4)Gd(釓）的負載：
[0018] 5~10mg的SWCNTs-HA-ss-DOX加入到水中，在冰浴中超聲5~60min分散， 離心棄去未分散的沉淀，成單壁碳納米管混懸液；室溫磁力攪拌條件下將50~80mg的 GdCl3粉末溶于水中，滴加到分散均勻的單壁碳納米管混懸液中，產生絮狀沉淀，即成Gd/ SWCNTs-HA-ss-DOX;
[0019] (5)制備 Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX 藥物納米劑：
[0020] 將步驟（4)含有絮狀沉淀的混合物離心2~30min，棄去上清液得沉淀，在沉淀中 加入表面活性劑溶液，冰浴超聲5~55min分散，然后離心2~25min，棄去沉淀，上清液透 析10-16h (過夜），再離心2~30min，棄去沉淀，即得透明質酸修飾單壁碳納米管制備診斷 治療的還原敏感性藥物納米劑（Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX);
[0021] 所述的表面活性劑為大豆卵磷脂，或大豆卵磷脂與泊洛沙姆的混合物，表面活性 劑溶液是由每l〇mg的表面活性劑加入lml的水制成。
[0022] 本發明透明質酸修飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納米劑在制 備腫瘤化療藥物和磁共振成像中的應用。
[0023] 本發明由HA修飾的SWCNTs通過對谷胱甘肽提供的還原性環境敏感的化合物 3, 3' -二硫代二丙酸作為連接臂和阿霉素的活性基團相連，然后將三氯化釓物理吸附到單 壁碳納米管，再用表面活性劑分散形成用HA修飾的SWCNTs用于診斷治療的還原敏感性藥 物的納米制劑。這種納米制劑作為新型藥物傳遞體系，具備生物相容性好、腫瘤靶向性好、 熱療與化療相結合、診斷與治療為一體的優點，是診斷和治療腫瘤藥物上的創新，經濟和社 會效益巨大。
【具體實施方式】
[0024] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0025] 本發明在具體實施中，是由以下實施例實現。
[0026] 實施例1
[0027] 本發明在具體實施中，由以下步驟實現：
[0028] (1)羧化碳管（即羧基化碳納米管）與氨化透明質酸連接（HA-SWCNTs):
[0029] 稱取50mg羧化碳管溶于20ml甲酰胺中，冰浴探超25min，成羧化碳管溶液；稱取 氨化透明質酸（HA-NH 2)80mg溶于10ml的甲酰胺中，成氨化透明質酸溶液；稱取EDC(1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺）160mg、NHS(羥基琥珀酰亞胺）90mg，用2. 5ml甲酰胺 渦旋溶解，加入到羧化碳管溶液中，攪拌室溫反應15min，成羧化碳管混合溶液；在氨化透 明質酸溶液中加入三乙胺150 y 1，然后將氨化透明質酸和三乙胺的混合溶液快速滴加至羧 化碳管混合溶液中，室溫反應24h，加入3倍體積預冷的丙酮，冷卻析晶，有機膜過濾，丙酮 洗滌沉淀，得沉淀物，沉淀物用水復溶，透析2d，凍干；
[0030] (2)制備 SWCNTs-HA-ss-COOH (即 HA 修飾的 SWCNTs 負載 3, 3' -二硫代二丙酸）：
[0031] 取l〇〇〇mg碳原子數2~12的3, 3' -二硫代二丙酸或辛二酸為連接臂，溶解于 甲酰胺中，EDC 1000mg、NHS 600mg分別渦旋溶解于甲酰胺中，將上述溶液混合攪拌活化 15min，成活化溶液；將HA-SWCNTs 200mg探頭超聲溶解，與活化溶液混合，室溫條件下攪 拌1~8h，所得產物通過丙酮冰浴析晶，過濾，收集沉淀，沉淀用水復溶，透析2d，除去多余 的 3, 3' -二硫代二丙酸、EDC、NHS 鹽，凍干，成 SWCNTs-HA-ss-C00H(HA 修飾的 SWCNTs 負載 3, 3' -二硫代二丙酸），4°C保存；
[0032] (3) SWCNTs-HA-ss-C00H 與 D0X (阿霉素）的連接成 SWCNTs-HA-