一種親水性基因運載實時示蹤器及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種親水性基因運載實時示蹤器及其制備方法，應用于基因治療中的熒光成像跟蹤。
【背景技術】
[0002]在過去的幾十年里，基因遞送和治療已經受到世界各地研宄學者的廣泛研宄。盡管病毒載體提供了更大的轉染效率，但是在安全性方面具有很大的問題。因此，設計出在靶器官和組織中能實現安全、高效，并具有靶向性的高基因表達的基因載體是至關重要的，這不僅能實現基因進入細胞，并且能夠示蹤其在細胞內循環的路徑。
[0003]近年來，關于藥物輸送和熒光成像已經得到了很好的研宄，但是熒光實時示蹤基因遞送的研宄還沒有得到很大的研宄。由于熒光蛋白、基因染料和納米顆粒可以與基因通過共價鍵結合，因此可以作為熒光載體，但是，新的化學鍵的生成也許會破壞基因，導致低的甚至失去基因轉染效率或者治療作用。為了保持基因的序列和結構不變，選擇一種新的基因運載方法至關重要。
[0004]由于基因上有大量的磷酸二酯鍵，因此基因序列是顯示負電性的，我們選擇帶有正電性的載體通過靜電作用與基因結合，將其載入體內，進行治療作用。通過這種物理作用，基因的原始性質保持不變，并且能夠得到高轉染效率和基因治療作用。目前，常用的基因運載體為聚合高分子，基因轉染效率好(Wang，W.；Nan, ff.J.；Sun, L.；Liu, ff.G.，React.Funct.Polym.2013, 73，993-1000.)，但是不能對基因運載過程進行實時示蹤。因此對熒光材料進行表面正電修飾又成為一大亮點，通過配體交換得到親水性正電熒光顆粒(Li, J.M.；Zhao, Μ.X.；Su, H.；ffang, Y.Y.；Tan, C.P.；Ji, L.N.；Mao, Z.ff., B1materials2011，32，7978-7987.)，這些方法將無機油相顆粒轉入水相的過程費時費力，配體交換修飾還會導致熒光性能降低。
[0005]因此發展新的合成方法，制備出分散性好、尺寸均一、熒光性能穩定、轉染效率高的親水性基因運載實時示蹤器，這對病理診斷和基因治療在臨床上的潛在應用具有重要的指導意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種親水性基因運載實時示蹤器及其制備方法。
[0007]本發明所述的親水性基因運載實時示蹤器是一種熒光納米球，其形貌為均勻的球形，粒徑在100-200nm范圍，表面具有強正電荷；所述的焚光納米球是在硫化鋅摻猛量子點表面包覆帶有正電的兩親性高分子；所述的帶有正電的兩親性高分子的正電單體為氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑。
[0008]本發明所述的親水性基因運載實時示蹤器的制備方法，其具體步驟如下:
[0009]e.向反應釜中加入0.5-1.5mL氯仿、0.13-0.15g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、0.05-0.1g甲基丙烯酸、4.0-5.0g苯乙烯、0.01-0.2g偶氮二異丁腈，攪拌混合均勻，80-120°C下加熱反應8-12h ；
[0010]f.待反應釜冷卻至室溫，然后加入甲醇得到沉淀，干燥后即為帶有正電的兩親性高分子;
[0011]g.將0.1-1.0mg聚乙二醇、50-300 μ L硫化鋅摻錳量子點的氯仿溶液、30.0-50.0mg步驟b得到的帶有正電的兩親性高分子、0.60-0.95mL氯仿混合均勻后，倒入
5-1OmL的pH = 8.0-10的氫氧化鈉水溶液中，超聲乳化得到白色乳濁液；
[0012]h.將步驟c的乳濁液在45_65°C水浴中攪拌加熱l_3h，待氯仿完全揮發后，自然冷卻至室溫，8000-11000r/min離心10_20min，最后將得到的沉淀分散到4_8mL超純水中，即得到帶有正電的親水性基因運載實時示蹤器。
[0013]上述的親水性基因運載實時示蹤器運載示蹤基因的方法為:將親水性基因運載實時示蹤器與基因按質量比10:1-50:1在37°C培養箱中孵育1-5小時，通過靜電作用得到親水性基因運載實時示蹤器與基因的復合體，該復合體與細胞37°C下共同培養。
[0014]本發明的有益效果:采用本發明所述的方法制得的親水性基因運載實時示蹤器，過程簡單易操作，裸露在示蹤器表面的正電咪唑可以與具有負電性的基因進行有效結合，包覆的紅色熒光硫化鋅摻錳量子點可實現基因遞送的實時可視化，實現既能運載基因序列又可以進行實時熒光示蹤的功能。合成過程中加入了可降解高分子聚乙二醇，在基因運輸過程中，聚乙二醇可以保護基因序列不被生物降解，并且可以整體降低基因運載實時示蹤器的細胞毒性。人體內的網狀內皮系統包括巨噬細胞、網狀細胞等，當大尺寸異物粒進入體內之后很容易被網狀內皮系統所清除，從而脫離血液循環，而尺寸在100-200nm之間的膠體微粒適合體內的運輸，不會被網狀內皮系統清除，更由于我們在其表面修飾了親水性官能團羧基和正電咪唑，這更有利于血液循環和體內循環過程；并且在水相中有很好的分散性和穩定性，每16.Smg熒光納米球示蹤器對應l_3mL去離子水。制得的親水性基因運載實時示蹤器具有很強的基因序列靜電結合能力，熒光穩定，毒性極低，并且基因轉染效率高，能夠在癌細胞細胞質中酸性條件下降解，這在生物技術領域，特別是基因治療中的熒光成像跟蹤領域具有重要的意義。
【附圖說明】
[0015]圖1:實施例1制得的親水性基因運載實時示蹤器的透射電鏡照片。
[0016]圖2:實施例1制得的親水性基因運載實時示蹤器的X射線衍射照片。
[0017]圖3:實施例1制得的親水性基因運載實時示蹤器與基因結合之后的透射電鏡照片。
[0018]圖4:實施例1制得的親水性基因運載編碼增強型綠色熒光蛋白質粒的凝膠電泳分析照片。
[0019]圖5:實施例1制得的親水性基因運載實時示蹤器實時熒光示蹤運載編碼增強型綠色熒光蛋白質粒過程的共聚焦顯微鏡照片。
[0020]圖6:實施例2制得的親水性基因運載實時示蹤器的透射電鏡照片。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022]1、向反應釜中加入1.0mL氯仿、0.184g氯化1-烯丙基_3_甲基咪唑、0.046g甲基丙烯酸、5.0g苯乙烯、0.096g偶氮二異丁腈，攪拌混合均勻，100°C下加熱反應1h ；
[0023]2、待反應釜完全冷卻至室溫，產物用甲醇沉淀干燥得到帶有正電的兩親性高分子;
[0024]3、將0.2mg聚乙二醇、150 μ L濃度lmol/L的硫化鋅摻錳量子點的氯仿溶液(錳的摩爾摻雜量為5% ) ,50.0mg步驟b得到的帶有正電的兩親性高分子、0.85mL氯仿混合均勻后，倒入1mL的pH = 9.0的氫氧化鈉水溶液，超聲乳化得到白色乳濁液；
[0025]4、超聲結束之后在50°C下水浴攪拌加熱1.5h，油相溶劑氯仿完全揮發后，自然冷卻至室溫，10000r/min離心15min，再將沉淀分散到6mL超純水中，即得到帶有正電的親水性基因運載實時示蹤器。其透射電鏡照片、X射線衍射照片如圖1，2所示。
[0026]5、基因運載實時示蹤器與編碼增強型綠色熒光蛋白質粒以40:1的質量比在37°C培養箱中孵育3小時，通過靜電作用得到基因運載實時示蹤器/編碼增強型綠色熒光蛋白質粒復合體，其透射電鏡照片如3所示。
[0027]6、基因運載實時示蹤器負載基因的能力通過瓊脂糖凝膠電泳來考察，我們選擇編碼增強型綠色熒光蛋白質粒作為基因模型。基因運載實時示蹤器與I Ug編碼增強型綠色熒光蛋白質粒以不同的