蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠的制作方法及在治療骨關節炎藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠的應用，特別涉及其在制備治療骨性關節炎藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]骨性關節炎最常見的骨科疾病之一，據統計，僅在西方大約就有12%的中老年人群患有不同程度的骨關節炎。在美國約有2700多萬人患有骨關節炎，其中60歲以上的人群中患病率可達50%以上，美國疾病防控中心和哈佛大學公共衛生部門的一項研宄表明骨關節炎是引起老年人殘疾的五個主要疾病之一。骨關節炎以關節表面軟骨的塌陷、壞死為特征，并伴隨著疼痛、關節腫脹、關節間隙變小、形成骨贅、關節畸形以及表面關節軟骨磨損后軟骨下骨的暴露。骨關節炎的發病率高、病程長嚴重影響我國和世界居民的健康水平。
[0003]目前臨床治療藥物主要為非甾體類抗炎藥，全身鎮痛藥(如對乙酰氨基酚)，糖皮質激素等。由于該疾病致殘率為53%，晚期往往需要外科手術治療，如關機置換術、截骨術，這些手術的費用高昂而且對患者的創傷都很大。骨關節炎的發病機制在學術界尚無清晰的概念，這為其藥物篩選開發帶來了極大的困難。骨關節炎通常是由不正常的力學刺激引起，引起關節軟骨的病變，關節軟骨由于缺乏血管，難以自發修復。
[0004]軟骨由軟骨細胞和大量的細胞外基質組成，蛋白聚糖是組成細胞外基質的一種主要成分。在骨關節炎的發展中，蛋白聚糖的降解被認為是一個重要的特征，在這之中蛋白聚糖酶被認為是起著重要的作用。轉基因小鼠的研宄表明ADAMTS-5是主要的降解蛋白聚糖的酶。目前部分研宄已經著眼于對ADAMTS-5有抑制作用的小分子抑制劑，然而截至目前，它們對軟骨缺損或者是OA治療效果的研宄幾乎沒有。透明質酸(HA)是臨床上常用的一種關節潤滑劑，被用于促進細胞分化和形態建成，治療炎癥以及創傷。HA以及它的衍生物已經被廣泛研宄，有研宄表明體外交聯的透明質酸水凝膠可以被用于促進軟骨再生。同時，由于凝膠可以作為藥物載體，將凝膠與藥物結合可以成為一種有效的治療軟骨缺損的方式。在這項研宄中，我們設計了一種體外交聯的透明質酸體系(兩種組分分別為乙醛和己二酸二酰肼)。擬探討結合體外交聯的透明質酸水凝膠和ADAMTS-5抑制劑對骨關節炎的治療作用。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有技術的不足，提出了一種蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠的方法及其在治療骨關節炎中的應用。
[0006]一種蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠的方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟:
步驟一:透明質酸醛基修飾將60mg的透明質酸先溶解在20ml的雙蒸水內，然后再加入218 μ I濃度為10 mg/mL的Na14，在室溫下反應兩個小時；然后加入0.2ml的己二醇攪拌I小時來終止反應，得到的混合物在水中透析三天；將得到的醛基修飾的透明質酸凍干再儲存在4°C的溫度下； 步驟二:透明質酸己二酸二酰肼修飾
將至少30倍摩爾濃度的己二酸二酰肼加入到3 mg/mL的HA中，然后把pH調整到6.8 ；在混合物中加入I mol/L的二氯乙烷和I mol/L的三氮唑，保持pH為6.8使其反應4小時；再通過調整pH到7.0將反應停止，得到的混合物在水中透析三天，將得到的己二酸二酰肼修飾的透明質酸凍干再儲存在4°C的溫度下；
步驟三:透明質酸體外交聯
將0.6mg的ADAMTS-5抑制劑和50ul的醛基修飾的透明質酸混合，再將混合液與50ul的己二酸二酰肼修飾的透明質酸混合，反應I分鐘內成凝膠狀。
[0007]所述蛋白聚糖酶抑制劑為ADAMTS-5抑制劑，所述ADAMTS-5抑制劑化學名稱為:5- ((4-氯代芐-3-三氟甲基-N-甲基-1氫-吡唑-4-甲基)亞甲基)-2-硫代噻唑烷-4-酮，分子式為 ^16H11ClF3N3OS3O
[0008]一種蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠在制備治療骨性關節炎藥物中的應用。
[0009]骨關節炎的治療目的是減輕或消除疼痛，矯正畸形，改善或恢復關節功能，改善生活質量，然而骨關節炎的發病機理和分子機制在學術界尚無清晰的概念，這為骨關節炎的藥物開發和診斷治療帶來了極大的困難，近年來，隨著研宄的深入，軟骨細胞外基質的降解和降解酶的表達增高被認為是骨關節炎發病的中心事件，本發明從ADAMTS-5抑制劑對骨性關節炎形成過程中蛋白聚糖的合成和其降解產物的表達入手，首先建立大鼠膝關節前交叉韌帶切除骨性關節炎模型，通過對關節腔注射蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠后大鼠膝關節病理組織學觀察并進行相應的組織學評分，觀察大鼠軟骨組織的破壞程度，以及蛋白聚糖的及其降解產物的表達情況，并通過空白組，模型組，體外交聯透明質酸水凝膠組，ADAMTS-5抑制劑組和ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠組用藥組的比較，來研宄蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠關節腔注射對大鼠骨性關節炎的防治作用，探討ADAMTS-5抑制劑對骨性關節炎轉歸機制的影響，表明ADAMTS-5抑制劑可通過促進蛋白聚糖的合成和抑制蛋白聚糖降解產物的表達來抑制骨性關節炎的病理過程，從而為該藥物的進一步臨床應用提供實驗依據。
[0010]SD大鼠20只抽取15只切除大鼠膝關節的前交叉韌帶進行骨性關節炎造模，造模后分為空白組，模型組，體外交聯透明質酸水凝膠組，ADAMTS-5抑制劑組和ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠組。骨性關節炎組6只腿造模后不做任何處理，體外交聯透明質酸水凝膠組6只腿造模3周后開始關節腔注射20 μ I透明質酸水凝膠，每周I次，ADAMTS-5抑制劑組6支腿造模3周后開始關節腔注射0.12mg ADAMTS-5抑制劑，每周I次，ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠組組6只腿造模3周后開始關節腔注射ADAMTS-5抑制劑結合透明質酸水凝膠，每周I次，實驗8周后處死所有大鼠，觀察各組大鼠膝關節病理組織學改變并進行相應的組織學評分。結果表明:ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠能有效緩解外傷導致的大鼠骨性關節炎進程，促進大鼠骨性關節炎膝蛋白聚糖的表達和抑制蛋白聚糖降解產物的表達。
[0011]本發明有益效果主要體現在:本發明所述蛋白聚糖酶抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠具有緩釋藥物的性能，能有效緩解大鼠骨性關節炎，促進大鼠骨性關節炎膝蛋白聚糖的表達和抑制蛋白聚糖降解產物的表達。此外，本發明結合生物材料和藥物，通過組織工程手段治療骨關節炎，利用關節腔給藥方式，減少了骨關節炎治療的創傷；緩釋給藥的給藥途徑，可以在提高局部藥物濃度的同時減少全身用藥產生相應的副作用，具有臨床應用前景。
【附圖說明】
[0012]圖1為透明質酸進行醛基修飾示意圖。
[0013]圖2為傅里葉紅外光譜檢測醛基修飾結果。
[0014]圖3為透明質酸進行己二酸二酰肼修飾示意圖。
[0015]圖4為核磁共振檢測己二酸二酰肼修飾結果。
[0016]圖5為所制備體外交聯透明質酸水凝膠緩釋牛血清蛋白曲線。
[0017]圖6為所制備體外交聯透明質酸水凝膠體外降解曲線。
[0018]圖7為軟骨組織切片的番紅-阿辛藍染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組，C為體外交聯透明質酸水凝膠組，D為ADAMTS-5抑制劑組，E為ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠組。
[0019]圖8為骨性關節炎組，體外交聯透明質酸水凝膠組，ADAMTS-5抑制劑組和ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠組織的Mankin組織學(Mankin HistologicHistochemical Grading System)評分。
[0020]圖9為軟骨組織切片蛋白聚糖降解產物免疫組化染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組，C為體外交聯透明質酸水凝膠組，D為ADAMTS-5抑制劑組，E為ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠組。
[0021]圖10為軟骨組織切片蛋白聚糖免疫組化染色圖，A為假手術組，B為骨性關節炎組，C為體外交聯透明質酸水凝膠組，D為ADAMTS-5抑制劑組，E為ADAMTS-5抑制劑結合體外交聯透明質酸水凝膠組。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
本發明實施例所用實驗材料:
實驗動物:雌性12周齡Sprague-Dawley大鼠15只SPF級浙江大學動物實驗中心提供。
[0023]實驗藥品:
ADAMTS-5抑制劑(114810):南京科佰生物科技有限公司
透明質酸，次碘酸鈉(Na104)和己二酸二酰肼:廣東阿拉丁公司
二氯乙烷(EDC):美國Sigma公司
蛋白聚糖抗體，蛋白聚糖降解產物抗體:美國Abcam公司
DAB顯色液:丹麥DAKO公司
其他試劑:國藥公司。
[0024]實驗儀器設備: 傅里葉紅外光譜儀瑞士 Nicolet公司核磁共振儀瑞士 Bruker公司水浴鍋金壇市國旺實驗儀器廠石蠟切片機德國MICROW公司顯微鏡攝影機日本OLYMPUS公司
BMJ-1II包埋機及冷凍臺中國常州中威電子儀器有限公司實施例1體外交聯透明質酸水凝膠制備和表征檢測
本發明采用體外交聯的方法制備透明質酸水凝膠:(I)透明質酸醛基修飾:60mg的透明質酸先溶解