貝母素甲用于制備新型免疫抑制劑的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及貝母素甲的新用途，尤其涉及貝母素甲用于制備新型免疫抑制劑的應 用。
【背景技術】
[0002] T淋巴細胞亞型參與免疫應答的各個階段，在免疫調節中發揮關鍵作用，當免疫調 控紊亂以及免疫平衡調節機制破壞時將會導致自身免疫疾病的發生。自身免疫性疾病主要 包括硬皮病、系統性紅斑狼瘡、血清病、類風濕性關節炎等，其發生的原因是由于對自己或 非己識別的控制機制出現了問題，使得一些自身反應性T細胞能夠逃避克隆清除，識別自 身的外周組織抗原并且引起自身免疫反應。通過調節T淋巴細胞膜離子通道功能來改變T 細胞的活性，可達到治療自身免疫疾病的目的。目前，傳統治療自身免疫疾病的方法均以免 疫抑制為主，主要以遏制自身反應性淋巴細胞的增殖為目的，非特異性免疫抑制劑的應用 以及特異地應用免疫耐受T細胞的疫苗會對整個免疫系統進行抑制，其結果往往導致疫苗 等毒性累積而出現嚴重副作用，同時會不同程度地影響機體正常免疫反應而降低機體對感 染和腫瘤等免疫作用。
[0003] 鉀通道在T淋巴細胞的活化中起重要作用，T淋巴細胞活化的關鍵磷酸酶是鈣依 賴的神經鈣蛋白磷酸酶，其中與T淋巴細胞關系最為密切的鉀離子通道是：電壓門控鉀通 道Kvl. 3和鈣激活依賴的鉀通道KCa3. 1 (也稱IKCal，KCNN4，hKCa4)。因此能選擇性抑 制電壓門控鉀通道Kvl. 3或鈣激活依賴的鉀通道KCa3. 1，都會影響T淋巴細胞的功能。
[0004]Kvl. 3鉀離子通道是人類T淋巴細胞上表達最豐富、生理功能最重要的一類電壓 依賴型鉀離子通道（PANYIG，2005JASONRetal，2010)，在T淋巴細胞的活化、增殖、分 化以及免疫功能調節中具有重要的作用，其表達數量與T細胞亞型、細胞分化狀態和細胞 活化狀態有關。Kvl. 3和11(&1共同為持續的鈣內流提供必需的陽離子流出平衡，T細胞活 化需要通過鈣釋放的鈣通道從外部環境持續輸入鈣離子，鈣離子內流使膜去極化。Kvl. 3的 開放適應膜的去極化和維持膜的靜息電位，而IKCal開放則增加胞質鈣和使膜電位超極化。 Kvl. 3是人類靜息T細胞鈣信號的基本調節器。
[0005] 鉀通道在T淋巴細胞的活化中起重要作用，開放通道增加跨膜電位負值，這就反 過來通過鈣釋放活化的鈣通道增加鈣內流，進一步導致鈣依賴的神經鈣蛋白磷酸酶活化， 后者是T淋巴細胞活化的關鍵磷酸酶。增加表達的鉀通道能明顯使活化的T淋巴細胞超極 化，加速的鈣內流保證了高水平的胞內鈣離子，后者是T淋巴細胞充分活化和產生細胞因 子所必須的。相應的，鉀通道阻滯劑使T淋巴細胞保持負性膜電位和長效鈣信號的能力降 低。CD8+細胞分為三個主要的亞群，分別是幼稚細胞、中心記憶細胞和效應記憶細胞。靜息 的人類T淋巴細胞表達Kvl. 3約300~400個/細胞，11(&1約8~10個/細胞，阻滯靜息 T細胞上的Kvl. 3能使膜電位從-50mV升到-30mV。靜息狀態，幼稚的中心記憶細胞（TCM) 和表達⑶4及⑶8的TCM都表達過多的Kv1. 3 (約200~300個/細胞），而IKCal僅僅表 達8~20個/細胞。幼稚的效應細胞和TCM在抗原或絲裂原刺激后表達相似數量的兩種 通道（(Kvl. 3約400~500個/細胞，11(&1約200~500個/細胞）。而抗原或絲裂原刺 激的CD4+和CD8+TEM，Kvl. 3表達增加至1500個/細胞，遠多于KCal的表達（約10個/ 細胞）。在人類的T淋巴細胞中，11(&1和Kvl. 3在T淋巴細胞的分化以及抗原介導的免疫反 應如細胞因子白細胞介素（IL)_2,腫瘤壞死因子（TNF)-A，干擾素（IFN)-C中起調節作用。
[0006] 因此，針對T淋巴細胞上的Kvl. 3和11(&1的鉀通道阻滯劑對抑制T淋巴 細胞增殖分化成為研宄的重點。早期研宄發現廣譜鉀離子通道阻滯劑4-氨基吡啶 (4-Aminopyridine，4-AP)能改善MS(多發性硬化癥）患者癥狀，但是由于其廣譜阻斷效應， 副作用多，限制了它的應用，因此以Kvl. 3和IKCal為靶點篩選出高選擇性的鉀離子通道阻 滯劑成為研宄的熱點。
[0007] 膜片鉗技術是用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細胞膜，以千兆歐姆以 上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區域（膜片）與其周圍在電學上 分隔，在此基礎上固定點位，對此膜片上的離子通道的離子電流（PA級）進行監測記錄的方 法。目前廣泛應用于神經（腦）科學、心血管科學、藥理學、細胞生物學、病理生理學、中醫 藥學、植物細胞生理學、運動生理等多學科領域研宄。
[0008] 本發明旨在利用膜片鉗技術研宄貝母素甲免疫抑制的作用機制。通過在通道電流 記錄中，分別于不同時間、不同部位（膜內或膜外）施加各種濃度的藥物，研宄它們對不同 電壓門控鉀通道功能的可能影響，其確定其是否對Kvl. 3鉀通道作用有選擇性阻滯作用。
[0009] 貝母素甲的概況
[0010] (1)貝母素甲（浙貝母堿）是從貝母類藥材中提取的一種生物堿，英文名稱： 卩611^116 ;貝母素甲的分子式為0271145勵3、分子量為431.6511，結構式如下：
[0012] (2)貝母素甲廣泛存在于貝母類植物中。川貝母、浙貝母、伊貝母、平貝母和瓦布 貝母都已被《中國藥典》收錄，藥典規定含貝母素甲（C27H45N03)和貝母素乙（C27H43N03)的總 量，不得少于〇. 080%。貝母來源于百合科貝母屬多種植物的鱗莖，具有清熱潤肺，化痰止 咳之功效。貝母中的生物堿種類多，是貝母止咳、化痰作用的有效成分。貝母為多年生草本 植物，葉子長形，似韭，花黃綠色，下垂像鐘，其鱗莖供藥用，有止咳化痰、清熱散結之功，產 于四川、云南、甘肅、新疆等地。貝母為名貴藥材，堪稱藥中之寶。新中國成立后曾列為國家 計劃管理品種，1980年以后改為市場調節產銷產品。40年來，貝母的生產有較大的發展，年 產量由20世紀50年代初的40多噸發展到2000年的2000噸左右，2014年產量估算接近 4000噸，產值接近70000萬元，具備較大的市場供應能力及開發潛力。
[0013] (3)貝母素甲的提取與純化方法：
[0014] 貝母素甲的提取方法大致有3類，一是傳統的搖床浸提法，為了提高生物堿的提 取率，人們還輔助添加了微波法和超聲法；二是滲漉法，可用不同濃度的鹽酸進行提取；三 是醇提法，常用80% -95%的甲醇或乙醇進行提取，人們還在醇提工藝前使用纖維素酶預 處理，降解細胞壁中的纖維素，促進有效成分溶出，提高提取率。
[0015] 常用的純化方法有：大孔樹脂純化法和萃取純化法兩種。
【發明內容】
[0016] 本發明的第一個目的是提供貝母素甲在制備用于選擇性抑制Kvl. 3離子通道的 藥物中的應用。本發明的第二個目的是提供一種新型免疫抑制劑。
[0017] 為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案：
[0018] 式（I)所示貝母類化合物或其藥物學上可接受的鹽在制備新型免疫抑制劑的應 用；所述的新型免疫抑制劑的作用機制主要通過選擇性抑制Kvl. 3鉀離子通道；
[0020] 作為優選，所述的免疫抑制劑預防和/或治療的自身免疫疾病包括器官特異性自 身免疫病和系統性自身免疫病；器官特異性自身免疫病中組織器官的病理損害和功能障礙 僅限于抗體或致敏淋巴細胞所針對的某一器官。
[0021] 作為優選，器官特異性自身免疫病包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰 島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血 腎炎綜合征（goodpasturesyndrome)、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、多發 性腦脊髓硬化癥和急性特發性多神經炎。
[0022] 作為優選，系統性自身免疫病包括硬皮病、紅斑狼瘡、類風濕性關節炎和結節性多 動脈炎。
[0023] 為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案：
[0024] -種新型免疫抑制劑，它的有效成分為上述的貝母類化合物或其藥物學上可接受 的鹽，其作用機制主要通過選擇性抑制Kvl. 3鉀離子通道。
[0025] 作為優選，所述的免疫抑制劑預防和/或治療的自身免疫疾病包括器官特異性自 身免疫病和系統性自身免疫病；器官特異性自身免疫病中組織器官的病理損害和功能障礙 僅限于抗體或致敏淋巴細胞所針對的某一器官。
[0026] 作為優選，器官特異性自身免疫病包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰 島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血 腎炎綜合征（goodpasturesyndrome)、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、多發 性腦脊髓硬化癥和急性特發性多神經炎。
[0027] 作為優選，系統性自身免疫病包括硬皮病、紅斑狼瘡、類風濕性關節炎和結節性多 動脈炎。
[0028] 本發明的有益技術效果：經過貝母素甲對Kvl. 2-Kvl. 8離子通道抑制作用的試 驗，發現貝母素甲能與Kvl. 3通道有較強選擇性結合，從而降低過度興奮的T淋巴細胞，減 弱對于T淋巴細胞的活化，從而降低T細胞活性，最終降低細胞免疫，而對其它鉀離子通道 作用很弱。由于貝母素甲是選擇性通過抑制Kvl. 3離子通道，可以降低如硬皮病，紅斑狼瘡 等免疫系統功能亢進疾病治療所引起的不良反應而不影響正常的免疫功能，因此這一類新 藥的開發具有重大意義。
【附圖說明】
[0029] 附圖1貝母素甲對Kvl. 3離子通道的抑制作用；
[0030]A不同濃度貝母素甲對Kvl. 3離子通道電流的影響；B貝母素甲對Kvl. 3峰值電流 的量效曲線；采用Hill方程式得出其50%抑制濃度（IC5Q)為354. 4yM(n= 6);
[0031]CKvl. 3電流激活后的150ms處出現對電流使用依賴性量效曲線；數據符合Hill 方程，50 %使用依賴性抑制濃度（use-dependentIC5(I)為 142. 1yM(n= 6)。
[0032] 附圖2貝母素甲對Kvl. 2離子通道的end-pulse(穩態后的）電流的抑制百分率；