同時預防新孢子蟲和弓形蟲感染的疫苗及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及寄生蟲病疫苗基因工程技術領域，提供一種同時預防新孢子蟲和弓形 蟲感染的疫苗及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 新孢子蟲病和弓形蟲病是嚴重危害養殖業健康發展和人類身心健康的主要寄生 蟲病，目前尚無有效的藥物和疫苗防控。
[0003] 新孢子蟲病是由犬新孢子蟲（Neospora caninum)寄生于犬、牛、羊等多種哺乳動 物細胞內而引起的一種原蟲病，該病主要引起母畜流產、死胎或新生兒運動障礙和神經系 統疾病。犬是新孢子蟲的終末宿主，多種哺乳動物都可以作為中間宿主，它的寄生部位是中 樞神經系統、腦、肝、肌肉及其它內臟組織。國外對新孢子蟲的研宄已取得了一定進展，而國 內對新孢子蟲的研宄尚屬起步階段。
[0004] 弓形蟲病是由剛地弓形蟲（Toxophasma gondii)引起的人畜共患病。該病多呈隱 性感染，主要侵犯眼、腦、心、肝、淋巴結等，蟲體可通過胎盤感染胎兒，引起孕畜早產、流產、 畸形胎等，嚴重危害人類及養殖業的健康發展。
[0005] 新孢子蟲與弓形蟲是親緣關系相近的細胞內寄生性原蟲，二者在形態結構、分子 生物學特征以及發病的臨床癥狀和病理變化等方面都很相似。AMl頂端膜抗原定位于微線 體，是新孢子蟲和弓形蟲的速殖子期和緩殖子期表達蛋白，與蟲體侵入宿主細胞和自身復 制的功能密切相關。AMl是新孢子蟲和弓形蟲一個潛在的共同候選疫苗抗原，可用來控制 新孢子蟲和弓形蟲的入侵。
[0006] 對于新孢子蟲疫苗的研宄大多采用傳統方法，如利用新孢子蟲表面抗原蛋白基因 制備重組蛋白亞單位疫苗，或利用真核表達載體制備核酸疫苗等，而制備的亞單位疫苗或 核酸疫苗均存在免疫效果不佳、保護率低下等問題，尚不能用于新孢子蟲病的有效防控； 而對弓形蟲疫苗的研宄雖然取得了一定進展，但疫苗的免疫效果也均不理想。并且，國內外 尚無同時預防新孢子蟲和弓形蟲疫苗的問世，也未見同時預防新孢子蟲和弓形蟲重組腺病 毒載體疫苗的相關報道。
【發明內容】
[0007] 本發明是鑒于現有技術中存在的上述問題而做出的，其目的是提供一種能夠同時 預防新孢子蟲和弓形蟲感染的疫苗，該疫苗為重組腺病毒載體疫苗，可用于同時預防新孢 子蟲和弓形蟲的感染。
[0008] 本發明的另一目的是提供一種編碼上述疫苗抗原的核苷酸序列。
[0009] 本發明的再一目的是提供一種上述疫苗的制備方法。
[0010] 本發明的又一目的是提供抗原的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2及SEQ. ID. NO. 4在制 備用于預防新孢子蟲和弓形蟲感染的疫苗中用途。
[0011] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[0012] -種同時預防新孢子蟲和弓形蟲感染的疫苗，該疫苗抗原的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2 及 SEQ. ID. NO. 4 所示。
[0013] 進一步地，所述疫苗抗原通過腺病毒載體進行表達。
[0014] 進一步地，所述腺病毒載體為 pCR259、HighQ-lTranspose-Ad?294 和 HighQ-l?。
[0015] -種編碼上述疫苗抗原的核苷酸序列，該核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1及SEQ. ID. NO. 3 所示。
[0016] -種制備同時預防新孢子蟲和弓形蟲感染的疫苗的方法，包括：
[0017] a.引物設計，根據新孢子蟲（AB265823. DAMAl基因序列和弓形蟲（AF010264. 1) AMl基因序列的開放閱讀框，設計新孢子蟲和弓形蟲交叉抗原AMl基因的通用引物P1、 P2,所述引物P1、P2為：
[0018] Pl :5, -CCGCTCGAGGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGAGTA-3'
[0019] P2 :5' -CTAGTCTAGATTAAGAATCCGAAACCAGGCA-3' ；
[0020] b.擴增與克隆，分別以新孢子蟲基因組DNA和弓形蟲基因組DNA為模板，以Pl和 P2為引物，對AMAl基因進行PCR擴增，將PCR擴增產物克隆于pMD18-T Simple Vector得 到pMD18-T-Nc/TgAMAl重組克隆質粒，進行PCR鑒定、酶切鑒定及測序分析；
[0021] c.亞克隆，將Nc/Tg AMAl基因亞克隆至pCR259腺病毒穿梭載體，構建重組腺病毒 穿梭質粒 pCR259-Nc/Tg AMAl ;
[0022] d.轉化，依次轉化HighQ-lTranspose-Ad?294和HighQ-l?感受態細胞，構建重組 腺病毒表達質粒H294-Nc/Tg AMAl ;
[0023] e.轉染，采用脂質體介導轉染法轉染QBI-HEK293細胞包裝重組腺病毒Ad5-Nc/ TgAMAl，檢測AMl基因在QBI-HEK293細胞中的表達；以及
[0024] f.疫苗制備，擴增，純化以制備所述疫苗。
[0025] 進一步地，所述新孢子蟲的擴增基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，所述弓 形蟲的擴增基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
[0026] 進一步地，所述PCR擴增的反應體系為25 μ L :10 X Buffer 2. 5 μ L、dNTP2 μ L、上 下游引物各1 μ L、模板DNA 2 μ UTaq酶0. 25 μ L以及滅菌去離子水16. 25 μ L ;所述PCR擴 增的反應條件為：95°C預變性5min，94°C變性45s，58°C退火45s，72°C延伸7min，4°C保存。
[0027] 進一步地，所述引物Pl含有XhoI酶切位點，所述引物P2含有XbaI酶切位點。
[0028] 本發明的同時預防新孢子蟲和弓形蟲感染的疫苗的制備方法，根據新孢子蟲 (AB265823. DAMAl基因序列和弓形蟲（AF010264. DAMAl基因序列的開放閱讀框，設計新 孢子蟲和弓形蟲交叉抗原AMl基因的通用引物，構建pMD18-T-Nc/TgAMAl重組克隆質粒、 重組腺病毒穿梭質粒pCR259-Nc/TgAMAl及表達質粒H294-Nc/TgAMAl，脂質體介導轉染至 QBI-HEK293細胞包裝Ad5-Nc/TgAMAl重組腺病毒，測定病毒滴度后擴增、純化制備Ad5-Nc/ Tg AMl重組腺病毒載體疫苗。
[0029] 本發明的疫苗能夠誘導免疫動物產生強烈的免疫應答反應，可應用于同時預防新 孢子蟲和弓形蟲的感染，該疫苗還可應用于用于同時預防新孢子蟲和弓形蟲的感染的藥劑 中。抗原的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2及SEQ. ID. NO. 4可應用于制備用于預防新孢子蟲和 弓形蟲感染的疫苗中。
[0030] 有益效果
[0031] 本發明的同時預防新孢子蟲和弓形蟲感染的重組腺病毒載體疫苗，經動物免疫試 驗和攻蟲試驗證實，能夠誘導免疫動物產生強烈的免疫應答反應，對新孢子蟲和弓形蟲攻 擊具有良好免疫保護作用，從而可以達到同時預防新孢子蟲和弓形蟲的目的。
[0032] 本發明應用的腺病毒載體轉基因效率高，可以有效地將外源基因表達成具有活性 的蛋白；可轉導不同類型的組織細胞，不受靶細胞是否為分裂細胞所限；容易制得高滴度 病毒載體；進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，安全性高。
【附圖說明】
[0033] 為使本發明的【具體實施方式】的描述更加清楚，下面對【具體實施方式】中使用的附圖 進行說明。
[0034] 圖1為新孢子蟲AMl基因和弓形蟲AMl基因的PCR擴增產物的電泳圖，其中，M 泳道代表DL2000DNA marker，1泳道代表PCR擴增新孢子蟲產物；2泳道代表PCR擴增弓形 蟲產物；3泳道代表PCR擴增水對照。
[0035] 圖2為包裝重組腺病毒Ad5-Nc/TgAMAl的QBI-HEK293細胞圖。
[0036] 圖3為攻擊新孢子蟲各免疫組及對照組BABL/c小鼠存活率圖。
[0037] 圖4為攻擊弓形蟲各免疫組及對照組BABL/c小鼠存活率圖。
【具體實施方式】
[0038] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明進行詳述。
[0039] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但不是對本發明保護范圍的限定。下述實 施例中的實驗方法如無特別說明均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料如無特別說 明均為常規市售生化試劑。
[0040] 本發明中的實驗材料來源：
[0041] 新孢子蟲：由延邊大學預防獸醫學實驗室從延邊地區流產牛腦組織分離獲得，并 由延邊大學預防獸醫學實驗室保存，關于該分離方法，申請人在申請號為201410550101. 6、 發明名稱為犬新孢子蟲的分離方法和體外培養方法的已公開專利申請文件中已詳細描述， 上述申請文件的全部內容引入于此作為參考。新孢子蟲基因組DNA由延邊大學預防獸醫學 實驗室提取。<