用于通過調整bmp-6來調節鐵穩態的方法和組合物的制作方法

用于通過調整bmp-6來調節鐵穩態的方法和組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2009年11月13日、發明名稱為"用于通過調整BMP-6來調節 鐵穩態的方法和組合物"的中國專利申請號200980145449. 4的分案申請。
[0002] 相關申請
[0003] 本申請要求于2008年11月13日申請的美國臨時專利申請61/114, 290以及于 2008年12月29日申請的61/141，155的優先權，這些申請的全部內容通過引用結合入本文 中。
技術領域
[0004] 本發明總體上涉及鐵穩態失調的治療、預防和改善。本發明更具體地涉及使用 BMP-6和BMP-6蛋白特異性試劑諸如抗體用于改變人的血清鐵、血清血紅蛋白和/或血細 胞比容水平的方法。此類抗體可用于預防和治療血色素沉著病和炎癥性貧血的藥物組合物 中。
【背景技術】
[0005] 鐵是幾乎每一種生物體生長和生存所需要的必需元素。紅細胞（RBC)含有血紅蛋 白（Hb)，其是一種紅色的富鐵蛋白，將氧從肺攜帶至身體的所有肌肉和器官，在此其反應而 為身體提供其正常活動的能量需求。當紅細胞的數目或它們含有的血紅蛋白的量降低至正 常水平以下時，身體接收到的氧和產生的能量小于其正常發揮功能所需要的氧和能量。這 種狀況通常稱為貧血。在嬰兒和兒童中貧血的常見病因是鐵缺乏。在美國中多達20%的兒 童和發展中國家中多達80%的兒童在18歲前的某個時候將發生貧血。Martin，P. L.等，The Anemias, Principles and Practices of Pediatrics(貧血，兒科學原理和實踐），1657(第 二版，Lippincott 1994) 〇
[0006] 在哺乳動物中，鐵平衡主要在十二指腸吸收膳食鐵的水平上進行調節。在人類中， 遺傳性血色素沉著病（HH)是由過多吸收膳食鐵引起血漿和多個器官（包括特別地胰腺、肝 臟和皮膚）中的鐵過載并且由于鐵沉積引起這些器官和組織損害而導致的一種常見的常 染色體隱性遺傳性疾病。
[0007] 青少年血色素沉著病是由編碼主要的鐵調節激素鐵調素（h印cidin) (HAMP)和血 幼素（hemojuvelin) (HFE2)的基因中的突變導致的一種鐵過載失調（Roetto，A.，等.2003. Nut. Genet. 33:21-22 ;Papanikolaou, G.，等 2004. Nut. Genet. 36:77-82.)。已經顯不血 幼素是一種骨形態發生蛋白（BMP)共同受體，且血幼素-介導的BMP信號調節鐵調素表達 和鐵代謝（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939.)。然而，鐵調素的體內內源性BMP調節物還未知。
[0008] BMP是TGF-β超家族的成員，該超家族由超過40種配體組成（Shi，Y.和 Massague，J. 2003. Cell 113:685-700.)。這些生長因子介導多種多樣的生物學過程，包括 細胞增殖、分化、凋亡和圖形化（patterning)。BMP/TGF-β超家族配體通過與I型和II型 絲氨酸-蘇氨酸激酶受體的復合物結合而啟動細胞內信號級聯放大。活化的受體復合物磷 酸化細胞內Smad蛋白，然后后者轉位至核中以調整基因表達。
[0009] 近年來，已經發現了 BMP信號傳導途徑在主要的鐵調節激素鐵調素的調 節中的作用（Babitt，J.L·，等 2006.Nat.Genet.38:531_539;Babitt，J.L.，H 等 J Clin Invest. 117:1933-1939 ;Wang，R. H.，等 2005.Cell Metab. 2:399-409.)。 被 肝臟分泌后，鐵調素通過減少鐵運輸因子（exporter)膜鐵轉運蛋白（ferroportin) 的細胞表面表達來抑制腸的鐵吸收和巨噬細胞的鐵釋放（Nemeth，E.，等2004. Science. 306:2090-2093)。通過施用鐵使鐵調素上調（Pigeon, C,等 2001. J. Biol. Chem. 276:7811-7819, Nicolas, G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110:1037-1044 ;Nemeth，E., 等 2004. J. Clin. Invest. 113:1271-1276·)，而貧血抑制鐵調素（Nicolas,G·，等 2002· J. Clin. Invest. 110:1037-1044)。鐵調素缺乏和不受抑制的膜鐵轉運蛋白活性是遺傳 性鐵過載失調遺傳性血色素沉著病的常見發病機制，其原因是HAMP本身、HFE2、HFE、 TFR2(編碼2型轉鐵蛋白受體）的突變以及罕見的SCLA0A1 (編碼膜鐵轉運蛋白）突變 (Pietrangelo，A. 2006. Biochim Biophys Actal763:700-710)。鐵調素還被炎性細胞因 子諸如IL-6上調，并且鐵調素過量與炎癥性貧血的發病機制有關（Pigeon，C，等2001. J. Biol. Chem. 276:781卜7819, Nicolas, G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110:1037-1044 ; Nemeth，E·，等 2004. J.Clin. Invest. 113:1271-1276 ;Nemeth，E·，等 2003. Blood. 101:2461-2463 ;Weiss，G.和 Goodnough，L. Τ· 2005. N. Engl. J. Med. 352:1011-1023 ; Andrews NC. 2008. Blood. 112219-30.)〇
[0010] 通過肝臟特異性條件性敲除共用的BMP/TGF- β細胞內介質Smad4 (Wang，R. Η.，等2005. Cell Metab. 2:399-409.)，或通過HFE2(其編碼BMP共同受體血幼素）的 突變（Papanikolaou，G·，等 2004. Nut. Genet. 36:77-82 ;Babitt，J.L·，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Huang，F.W.，等 J. Clin. Invest. 115:2187-2191 ;Niederkofler，V.，Sa lie, R.，Arber，S. 2005. J Clin Invest. 115:2180-6)，減少肝臟BMP信號傳導與不適宜的低 鐵調素表達和鐵過載相關。BMP信號在體外轉錄水平上正向地增加鐵調素表達（Babitt，J. L·，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt，J.L.，H 等 J Clin Invest. 117:1933-1939; Wang, R. Η·，等 2005. Cell Metab. 2:399-409 ;Truksa, J.，等 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:10289-10293 ;Verga Falzacappa，M.V·，等 2008. J Mol Med. 86:531-40·)。在體 內施用鐵增加肝臟BMP信號傳導（Yu，P.B.，等2008. Nut Chem Biol. 4:33-41)。在體內施 用BMP增加鐵調素表達并減少血清鐵（Babitt，J.L.，H等J Clin Invest. 117:1933-1939)。 相反，在體內施用與人免疫球蛋白Fe的Fe部分融合的可溶性血幼素（HJV. Fe)(其選擇性 地抑制BMP-2、BMP-4、BMP-5和BMP-6,但不抑制BMP-7或BMP-9)，在體內抑制鐵調素表達， 增加膜鐵轉運蛋白表達，動員網狀內皮細胞鐵儲備，和增加血清鐵（Babitt，J. L，等2007. J Clin Invest. 117:1933-1939.)。施用非選擇性小分子BMP抑制劑Dorsomorphin也在體 內抑制鐵調素表達和增加血清鐵（Yu，P.B.，等2008. Nut Chem Biol. 4:33-41)。
[0011] 血幼素（也稱為RGMc)是蛋白質的排斥導向分子（Repulsive Guidance Molecule)家族的成員，包括RGMa和DRAGON (RGMb)，它們共享50-60 %氨基酸同一性 (Samad, T. A.，等 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036.)。象血幼素一樣，RGMa (Babitt, J. L·，等 2005. J. Biol. Chem. 280:29820-29827)和 DRAGON(Samad，T.A·，等 2005. J. Biol. Chem. 280:14122-14129)也起BMP信號傳導途徑的共同受體的作用。
[0012] 存在著對用于調節鐵調素表達和鐵代謝的低成本的有效方法的需求。

【發明內容】

[0013] 本發明提供了調整BMP-6的新方法，所述方法用于治療由于鐵調素缺乏引起的鐵 過載失調或由于鐵調素過量引起的炎癥性貧血。
[0014] 本發明涉及BMP信號傳導途徑的調節物，所述調節物在由于鐵調素缺乏引起的鐵 過載失調或由于鐵調素過量引起的炎癥性貧血的治療中發揮作用。
[0015] 本發明涉及一種用于調節受試者中鐵穩態的方法，所述方法包括向所述受試者施 用有效量的藥物組合物，所述有效量以足以改變所述受試者中的鐵穩態、血紅蛋白水平和 /或血細胞比容水平的水平來調整BMP-6信號傳導。在一些方面，所述組合物的施用減少 BMP-6信號傳導。在一些方面，所述組合物包含能夠結合BMP-6的試劑。在一些實施方案 中，所述試劑在殘基TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO: 3)處結合BMP-6。在一些方面，所述試劑 是抗體。在一些方面，所述抗體競爭性地抑制BMP-6與可溶性人血幼素蛋白的結合。在某 些具體實施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. Hi s。在其他方面，所述抗體通過 在與可溶性人血幼素蛋白結合BMP-6的結構域無關的結構域處結合BMP-6來抑制BMP-6活 性。在某些具體的實施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. His。
[0016] 本發明涉及其中化合物的施用減少血幼素-介導的對鐵調素表達的誘導的方法。 在一些方面，所述試劑以足以抑制血幼素和BMP-6之間的相互作用的量施用。在一些方 面，所述試劑優選地對人BMP-6的表達或活性的抑制超過對BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或 BMP-9的抑制。在一些方面，所述試劑結合BMP-6的親和性比結合BMP-7的親和性大至少5 倍。
[0017] 本發明提供了施用本發明的組合物的方法，其導致受試者中的血清鐵水平增加或 血清轉鐵蛋白飽和度增加。本發明還提供了施用本發明的組合物的方法，其導致血紅蛋白 或血細胞比容水平增加。
[0018] 本發明提供了施用本發明的組合物的方法，其導致BMP-6信號傳導的增加。在 一些方面，所述組合物包含能夠增加血清BMP-6水平的試劑。在一些方面，所述試劑增加 BMP-6表達水平。
[0019] 本發明提供了治療受試者的方法，所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或 多種癥狀，所述癥狀選自：增加的血清鐵水平、增加的血清轉鐵蛋白飽和度、減少的鐵調素 表達、減少的脾鐵儲備、增加的膜鐵轉運蛋白表達和組織鐵過載。
[0020] 本發明提供了施用該組合物的方法，其減小BMP-6的表達水平。在一些方面，所述 組合物包含能夠抑制BMP-6基因表達的試劑，其中所述試劑為反義DNA、siRNA、干擾RNA、微 小RNA(miRNA)或反義RNA，且其中BMP-6表達的減少足以增加所述受試者中的血清鐵水平 或血清轉鐵蛋白飽和度。
[0021] 本發明提供了一種分離的單克隆抗體，其特異性地結合人BMP-6,其中所述人 BMP-6由SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列組成，并且所述結合抑制BMP-6的鐵調節活性， 并且提供了包含所述分離的單克隆抗體的組合物，所述組合物包含足以增加受試者中的血 清鐵水平或血清轉鐵蛋白飽和度的量的抗體。在一些實施方案中，分離的單克隆抗體競爭 性地抑制可溶性人血幼素蛋白與BMP-6的結合，從而將與BMP-6的結合減少25% -100%。 在某些具體實施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fe或HJV. His。在更具體的實施方 案中，分離的單克隆抗體競爭性地抑制BMP-6與抗BMP-6抗體的結合達25% -100%，所述 抗BMP-6抗體選自R&D Systems的針對人BMP-6的單克隆抗體，MAB507 (克隆74219) ;R&D systems的針對BMP-6的多克隆抗體，AF507 (lot CXL04A);和Santa Cruz多克隆抗體。在其 他實施方案中，分離的單克隆抗體在與結合HJV. Fc的結構域不同的結構域處結合BMP-6。
[0022] 本發明還提供了抗BMP-6抗體諸如人抗體，由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、 單鏈Fv片段、F(ab'） 2片段、Fd、結構域抗體（dAb)、雙抗體、maxibody和納米抗體。在一些 方面，分離的單克隆抗體結合人BMP-6和鼠 BMP-6兩者。
[0023] 本發明還提供了分離的核酸分子和表達載體，所述核酸分子包含編碼抗BMP-6抗 體的核苷酸序列，所述表達載體包含與調控序列可操作地連接的所述核酸分子。
[0024] 本發明還提供了一種使用包含要求保護的載體或核酸分子的宿主細胞產生抗體 的方法，所述方法包括在合適的條件下培養要求保護的宿主細胞使得表達所述核酸以產生 所述抗體。
[0025] 本發明還提供了通過施用治療有效量的（a)足夠以足以改變鐵穩態、血紅蛋白 水平和/或血細胞比容水平的水平調整BMP-6信號傳導的藥物組合物和（b)紅細胞生成 刺激物來治療受試者的方法，所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或多種癥狀。 示例性的紅細胞生成刺激物包括促紅細胞生成素、促紅細胞生成素激動劑變體、以及結 合和活化促紅細胞生成素受體的肽或抗體。紅細胞生成刺激物包括，但不限于，α依伯 汀（epoetin alfa)，β 依泊汀（epoetin beta)，δ 依泊汀（epoetin delta), ω 依泊汀 (epoetin omega), ι 依泊汀（epoetin iota), ζ 依泊汀（epoetin zeta)和它們的類似物， 模擬肽（mimetic peptide)、模擬抗體（mimetic antibody)和HIF抑制劑（參見美國專利 公布號2005/0020487,其全部公開內容通過引用合并）。具體地，促紅細胞生成素包括，但 不限于，如下列專利或專利申請中公開的促紅細胞生成素分子或其變體或類似物：美國專 利號 4, 703, 008 ;5, 441，868 ;5, 547, 933 ;5, 618, 698 ;5, 621，080 ;5, 756, 349 ;5, 955, 422 和 5, 856, 298;和 WO 91/05867 ;W0 95/05465 ;W0 00/24893 和 WO 01/81405,每一篇專利或專 利申請的全部內容通過引用合并入本文中。在某些示例性實施方案中，紅細胞生成刺激物 選自由人促紅細胞生成素和α達貝泊汀（darbepoetin)組成的組。
[0026] 本發明還提供了一種診斷與BMP-6相關的失調的方法，所述方法包括：(a)使來 自懷疑患有所述失調的人的生物樣品與特異性結合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人 BMP-6結合的條件下接觸；和（b)定量與所述抗體結合的BMP-6,其中如在（b)中所定量的 在所述樣品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關的失調。
[0027] 本發明還提供了一種監測其中施用BMP-6拮抗劑的治療的方法，所述方法包括： (a) 使來自已經施用了 BMP-6拮抗劑的人的生物樣品與特異性結合BMP-6的抗體在適合于 所述抗體與人BMP-6結合的條件下接觸；和（b)定量與所述抗體結合的BMP-6,其中如在 (b) 中所定量的血清BMP-6水平的量的變化指示BMP-6拮抗劑的功效。在一些方面，所述拮 抗劑是抗體或小分子。
[0028] 本發明還提供了一種治療具有升高的鐵水平或患有貧血的哺乳動物的方法，所述 方法通過施用調整BMP-6信號傳導的藥物組合物進行。
[0029] 本發明還提供了一種用于治療與鐵穩態相關的失調的試劑盒，所述試劑盒包含制 品，所述制品包括包含抗BMP-6抗體的小瓶或預充式注射器。
[0030] 本發明還提供了一種篩選與人BMP-6結合的化合物的方法，該方法包括使候選化 合物與包含生物活性BMP-6的組合物接觸，和檢測所述候選化合物和所述組合物中的人 BMP-6之間的復合物，其中檢測到復合物指示所述候選化合物與人BMP-6的結合，并且進一 步其中所述候選化合物將BMP-6與HJV. Fc的結合抑制至少25%。
[0031] 本發明還提供了一種生成針對人BMP-6的抗體的方法，該方法包括將免疫球蛋白 生成細胞與包含SEQ ID NO: 1的BMP-6序列或其變體的多肽接觸，并分離由所述細胞產生 的免疫球蛋白。
[0032] 本發明還提供了一種用于治療缺鐵性失調的組合物，其包含特異性結合BMP-6和 HJV. Fc的抗體。在一個實施方案中，抗體競爭性地抑制可溶性人血幼素綴合物（HJV. Fe)蛋 白與BMP-6的結合。在另一個實施方案中，抗體競爭性地抑制可溶性人血幼素綴合物（HJV. Fe)蛋白與BMP-6的結合。在另一個實施方案中，抗體結合BMP-6上的與結合HJV. Fe的結 構域不同的結構域。
[0033] 在另一個具體實施方案中，抗體的量足以將HJV.Fc與BMP-6的結合減小 25% -100%。優選地，抗體選自由RandD系統單克隆抗體、RandD系統多克隆抗體和Santa Cruz多克隆抗體組成的組。在另一個具體實施方案中，抗體是人抗體。在其他實施方案中， 所述抗體選自由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、單鏈Fv片段、F (ab'）2片段、Fd、結構域 抗體（dAb)、雙抗體（diabody)、maxibody和納米抗體組成的組。
[0034] 本發明還提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼特異性結合BMP-6的抗體的核 苷酸序列。本發明還提供了一種包含與調控序列可操作地連接的此核酸分子的表達載體。 本發明還提供了包含權利要求31所述的載體或權利要求30所述的核酸分子的宿主細胞。
[0035] 本發明還提供了一種使用權利要求32所述的宿主細胞產生抗體的方法，其包括 在合適的條件下培養該權利要求所述的宿主細胞使得所述核酸表達以產生所述抗體。
[0036] 本發明還提供了一種診斷與BMP-6相關的失調的方法，所述方法包括：使來自懷 疑患有所述失調的人的生物樣品與特異性結合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6 結合的條件下接觸；和定量與所述抗體結合的BMP-6,其中如在（b)中所定量的所述樣品中 BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關的失調。