超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物及其制備方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明屬于納米醫學技術領域，特別涉及一種超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物及其制備方法。
【【背景技術】】
[0002]佐劑是疫苗的重要組成部分，缺乏佐劑，絕大多數蛋白抗原很難引起機體強有力的免疫反應。目前應用于人體的佐劑主要是鋁佐劑及MF59佐劑，但這兩種佐劑難以引起機體強有力的細胞免疫反應即殺傷性免疫反應。
[0003]金納米粒子因為制備方法簡單、穩定、生物相容性好等特點在生物上有廣泛的應用。目前已經有關于金納米粒子用于增強機體免疫反應的研究報道。金納米粒子與蛋白復合物應用于免疫反應主要是增強機體的體液免疫反應即抗體反應；且由于金納米粒子負載蛋白抗原的能力較低，如果需要提高金納米粒子對蛋白抗原的負載能力，需要對蛋白抗原進行修飾(如巰基化)，這限制了金納米粒子在機體免疫方面的應用。
【
【發明內容】
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[0004]為了克服現有的金納米粒子在蛋白抗原負載及引起細胞殺傷性免疫反應不足等缺點，本發明的首要目的在于提供一種超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的制備方法。
[0005]本發明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物，以作為一種新型的佐劑，增強機體的細胞免疫反應。
[0006]本發明的目的通過以下技術方案實現:一種超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的制備方法，包括如下步驟:
[0007](I)將濃硫酸和硝酸按體積比10:1-1:1混合后加入石墨，均勻分散后于80_150°C加熱攪拌5min-24h，冷卻至室溫后加水稀釋，調節pH值至中性，過濾，取濾液透析，得到超小氧化石墨烯；每毫升硝酸加入1-1OOOmg石墨；
[0008](2)將水加入步驟(I)的超小氧化石墨烯中，然后加入氯金酸溶液，0_60°C攪拌5min-24h后透析，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料；每一毫克超小氧化石墨烯加入1-1OOml水，水與氯金酸溶液的體積比為20:1-200:1 ;氯金酸溶液與超小氧化石墨烯的質量比為0.1-100:1 ；
[0009](3)將步驟(2)的超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料與蛋白抗原按體積比1:3-10:3混合，室溫震蕩過夜后離心，取沉淀，除去雜質，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物；所述的超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料與卵清蛋白的濃度比為1:2-2:1。
[0010]步驟(I)中:
[0011]所述的均勻分散優選為室溫水浴超聲l-15min ；
[0012]所述的pH值調節優選采用碳酸氫鈉進行調節；
[0013]所述的過濾優選采用濾紙進行過濾；
[0014]所述的透析優選為于截留分子量1000-10，OOODa的透析袋中透析48h ；
[0015]所述的超小氧化石墨烯的直徑優選為3_5nm ；
[0016]所述的硝酸優選為發煙硝酸或硝酸；
[0017]透析得到的超小氧化石墨烯的濃度較低，可以利用真空旋轉蒸發儀于70°C進行水浴濃縮，得到黃褐色的超小氧化石墨烯。
[0018]步驟(2)中:
[0019]所述的透析優選為于截留分子量1000-100，OOODa的透析袋中透析24h ；
[0020]所述的氯金酸溶液優選為10mg/mL的氯金酸溶液；
[0021]透析得到的超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料的濃度較低，可以利用真空旋轉蒸發儀于70°C進行水浴濃縮，得到濃度較高的超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料。
[0022]步驟(3)中:
[0023]所述的離心優選為于4000rpm、4°C離心1min ；
[0024]所述的除去雜質優選采用以下步驟進行:將沉淀加水或PBS進行重懸，離心洗滌后再加水或PBS進行重懸，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物；
[0025]所述的離心洗滌優選為于12000rpm離心洗滌兩次；
[0026]所述的水均為純凈水。
[0027]所述的蛋白抗原優選為病毒性外殼蛋白或腫瘤細胞表面特異性蛋白抗原。
[0028]一種超小氧化石墨烯-金納米粒子復合物，由上述制備方法得到。
[0029]本發明相對于現有技術具有如下的優點和有益效果:
[0030](I)本發明通過濃硫酸和硝酸氧化石墨得到超小氧化石墨烯，其制備方法簡單，成本低，產率高，達60%，得到的超小氧化石墨烯粒徑均一，為3-5nm，可以在培養基和鹽溶液中穩定存在，保證了可以作為佐劑的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的生物學效應的穩定性，這對于保證疫苗的穩定是很重要的。
[0031](2)本發明利用超小氧化石墨烯分子自身的還原性，還原氯金酸，原位合成金納米粒子，形成超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料；超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料通過π-π堆垛、疏水相互作用、靜電作用及形成Au-S鍵等方式負載蛋白抗原，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物。該制備方法簡單，價格低廉，所采用的超小氧化石墨烯-金納米粒子具有良好的生物相容性，能極大的提高金納米粒子對蛋白抗原的負載效率，并提高了機體對蛋白抗原的免疫反應效果，尤其是細胞免疫反應效果。
【【附圖說明】】
[0032]圖1是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的合成示意圖；
[0033]圖2是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的透射電鏡照片；
[0034]圖3是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的紫外可見吸收光譜圖；
[0035]圖4是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物激發小鼠體液免疫反應性能示意圖；
[0036]圖5是實施例1的超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物激發小鼠細胞免疫反應流式細胞分析圖；
[0037]圖6是效果實施例的超小氧化石墨的透射電鏡照片；
[0038]圖7是效果實施例的超小氧化石墨烯在純水和PBS中分散性能的對比結果圖。【【具體實施方式】】
[0039]下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的保護范圍并不限于此。
[0040]實施例1
[0041](I)超小氧化石墨烯的制備:
[0042]將15mL濃硫酸和5mL發煙硝酸混合，然后加入0.2g石墨，混合均勻后水浴室溫超聲1min,然后于120°C攪拌30min,冷卻至室溫后加入10mL水稀釋,并用碳酸氫鈉調節PH值到中性；采用濾紙過濾后，將溶液裝入透析袋(截留分子量SOOODa)中，在水中透析48h(去除溶液中的鹽)，透析后的溶液即為超小氧化石墨烯，此時制備得到的超小氧化石墨烯濃度較低，采用真空旋轉蒸發儀、于70°C進行水浴濃縮，得到黃褐色超小氧化石墨烯。
[0043](2)超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料的制備:
[0044]將3mg步驟(I)的超小氧化石墨烯加水稀釋至30ml,然后加入150 μ L、10mg/L的氯金酸溶液，混合后室溫攪拌40-45min后，用水透析(透析袋截留分子量50，OOODa) 24h以去除沒有反應的氯金酸，得到超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料；此時制備得到的超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料濃度較低，可采用真空旋轉蒸發儀、于70°C進行水浴濃縮。
[0045](3)超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的制備及應用:
[0046]取5mll.5mg/mL步驟(2)制備的超小氧化石墨-金納米粒子復合材料與3mLlmg/mL的卵清蛋白(OVA)混合，室溫下震蕩過夜后4000rpm、4°C離心lOmin，取沉淀用600 μ L水重懸，12000rpm離心洗漆兩次,再用600 μ L水重懸,得到超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物(即“超小氧化石墨烯-金納米粒子OOVA”)。
[0047]取上述超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物進行透射電鏡實驗；結果如圖2所示，從圖2可以看出，在超小氧化石墨烯上原位合成了 5-10nm的金納米粒子。超小氧化石墨烯-金納米粒子免疫復合物的紫外吸收光譜如圖3所示，從圖3可以看出，蛋白抗原已經成功負載在了超小氧化石墨-金納米粒子復合材料的表面。
[0048]以C57BL/6小鼠為模型，比較了 OVA、鋁佐劑與OVA混合物、超小氧化石墨烯-金納米粒子@ova引起的小鼠體液和細胞免疫反應性能。
[0049]將上述材料按每只小鼠50 μ g(按OVA的量計算)終體積100 μ L材料皮下注射免疫小鼠，一周免疫一次，共免疫三次。然后在第一次免疫后第21天摘除眼球取血處死小鼠,收集血清及脾臟細胞。血清用于檢測小鼠產生的抗OVA抗體。與OVA及鋁佐劑OVA混合物的免疫活性相比，在免疫21天后，超小氧化石墨烯-金納米粒子@0VA能提高小鼠產生抗OVA抗體的能力，結果如圖4所示。將脾臟細胞按I X 16/孔的量種植于48孔板中，然后與終濃度為10 μ g/mL的OVA孵育66h后，收集脾臟細胞，利用ant1-CD3e_PE及ant1-CD4_FITC抗體染色，檢測脾臟細胞中OVA特異性⑶4+T所占的比例。利用ant1-⑶3e-PE及ant1-⑶8a_FITC抗體染色，檢測脾臟細胞中OVA特異性CD8+T所占的比例。與鋁佐劑OVA混合物的免疫活性相比，超小氧化石墨烯-金納米粒子OOVA不但促進小鼠的抗原特異性CD4+T免疫反應，還能提高機體的CD8+T細胞免疫反應即機體的殺傷性免疫反應,結果如圖5所示。
[0050]實施例2
[0051](I)超小氧化石墨烯的制備:同實施例1的步驟(I)；
[0052](2)超小氧化石墨烯-金納米粒子復合材料的制備:同實施例1的步驟(2)；
[0053](