小白菊內酯在抑制牙周細胞炎癥和骨質破壞藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，特別是小白菊內酯在牙周膜韌帶細胞炎癥反應控制和抑制 骨質破壞方面的藥物應用。
【背景技術】
[0002] 牙體周圍組織感染如根尖周炎和牙周炎等疾病引起的牙槽骨吸收破壞是口腔臨 床常見的問題，嚴重者可導致牙齒松動、移位甚至脫落。牙周炎患病率在成年人中高達90%， 牙周炎引起的牙周組織缺損是造成中老年牙齒松動和脫落的主要原因。臨床常用的牙周齦 下刮治和根面平整術能有效的去除病原微生物，但如何有效控制炎癥，使已經破壞的牙體 周圍組織生理性再生是口腔臨床治療的目標，也是牙周治療的關鍵和難點。牙體周圍組織 炎癥常累及牙骨質、牙周膜和牙槽骨等組織。牙槽骨的形成和吸收是成骨和破骨功能的動 態平衡。牙槽骨細胞和具有分化潛能的牙周膜韌帶細胞在維持骨生成起著重要作用，破骨 細胞及其前體巨噬細胞發揮骨吸收和溶解的作用，兩者在生理狀態下相互協同，完成骨形 成和重塑。
[0003] 目前上市的牙周局部用藥以抗生素類為主，易引起細菌耐藥性等不良后果。并且 牙周炎在經過牙周刮治和根面平整等治療后，大多數病人已達到控制細菌感染的效果，并 不需要局部抗生素類藥物的輔助治療。然而，炎癥導致骨質破壞和新骨形成受阻機制是近 年來研宄的熱點和難點。目前臨床上非留體類消炎藥（NSAIDs)是使用最多的消炎止痛藥 物，其作用機理是抑制環氧化物酶（C0X-2)和前列腺素的合成。然而牙周組織炎癥的持續 是多種炎癥因子的綜合作用結果，同時涉及到牙周膜韌帶細胞，成骨細胞，破骨細胞及其前 體巨噬細胞的正常生理功能。研宄巨噬細胞、破骨細胞和成骨細胞參與炎癥性骨吸收和生 成機制，尋找新的藥物治療作用靶點，利用調控炎癥信號通路的藥物有效控制病變區牙槽 骨的降解，促進牙槽骨、牙周骨組織和根尖周組織的有序再生，具有重要的臨床意義。
[0004] 研宄表明，核轉錄因子（nuclear factor kappa b，NF-κ B)信號通路不僅是調控 炎癥反應基因表達的關鍵因子，也是調控破骨細胞分化成熟和影響細胞成骨分化的重要調 節因子。小白菊內醋（Parthenolide，PTL)是特異性阻斷NF- κ B信號通路的天然產物類藥 物。PTL是一種天然倍半萜烯內酯類藥物，具有鎮痛、抗菌及抗腫瘤作用，常用來治療發熱、 偏頭痛及關節炎等疾病。體外實驗證實PTL具有抑制多種炎癥因子合成和釋放的作用，通 過對IL-1，IL-6, TNF- a，IL-8,前列腺素，C0X2及一氧化氮合成酶（NOS)等細胞因子的抑 制而發揮抗炎作用。動物實驗證實PTL可通過抑制NF- κ B的活性，降低血液循環中IL-6 和TNF的含量，從而阻斷脂多糖（LPS)誘導的炎癥反應。另外，在巨噬細胞和破骨細胞的研 宄中發現PTL能夠抑制LPS誘導的NF- κ B活化，ρ65核轉位及I- κ B降解。以上研宄提示， PTL抗炎的藥理活性是通過抑制NF- κ B信號通路實現的。
【發明內容】
[0005] 本發明研宄目的是研發一種抑制牙周膜韌帶細胞炎癥反應和抑制牙周組織骨質 破壞的牙科局部用藥物。該藥物在臨床上作為牙周刮治和手術治療后的輔助藥物治療使 用，從而達到促進牙周組織修復和再生的目的。
[0006] 小白菊內酯作為一種藥物活性成分，可以按照常規的提取方法在倍半萜烯內酯類 植物中提取。發明人通過實驗研宄發現，PTL適宜于牙周韌帶細胞生長的濃度范圍(低于或 等于5μΜ)，在細菌內毒素（LPS)體外模擬牙周的炎癥反應中，PTL的應用可顯著降低牙周韌 帶細胞中炎癥因子IL-1，IL-6和TNF-α的基因表達，同時抑制了破骨細胞活化相關基因 RANKL和M-CSF，上調RANKL的拮抗因子OPG的表達。并且PTL通過抑制ρ50的表達和抑制 I- κ B降解從而抑制牙周韌帶細胞中NF- κ B信號通路的激活。以上研宄顯示小白菊內酯具 有抑制牙周膜韌帶細胞炎癥反應的作用。
[0007] 牙體周圍骨組織的修復依賴于具有分化潛能的牙周膜韌帶細胞，破骨細胞及其 前體巨噬細胞發揮骨形成和溶解的作用。兩者在生理狀態下相互協同，完成骨形成和重 塑。發明人構建牙周膜韌帶細胞和巨噬細胞共培養的模型，通過實驗研宄發現PTL抑制了 巨噬細胞向破骨細胞分化成熟，并且下調破骨功能相關的關鍵基因，如RANK，Calcitonin Receptor，Carbonic Anhydrase II，MMP-9, Cathepsin K 和 TRAP。以上結果顯不 PTL 具有 抑制破骨細胞的分化和抑制骨質破壞的功能。
[0008] 本發明人的藥效學實驗表明，小白菊內酯對牙周膜韌帶細胞炎癥反應和骨質破壞 模型具有顯著抑制作用，具體分析見實施例1。
[0009] 作為本發明的有益效果： 小白菊內酯PTL具有抑制牙周組織炎癥反應的作用，同時抑制破骨細胞的分化和破骨 功能，具有抑制骨質破壞的作用，其作用機制是通過抑制NF- κ B信號通路實現的。
[0010] 小白菊內酯對牙周炎具有潛在的治療價值。
[0011] 作為新一代靶向抑制NF-κ B信號通路的抗炎和抗骨質破壞的天然產物類藥物， 具有廣闊的臨床應用前景。
[0012] 小白菊內酯PTL可制成PTL緩釋凝膠，作為牙周治療后的輔助藥物治療，置于牙周 袋內和牙周患處，達到促進牙周組織修復和再生的目的。
【附圖說明】
[0013] 圖1為小白菊內酯（PTL)對PDLCs細胞增殖能力的影響的示意圖； 圖2為小白菊內酯（PTL)對TOLCs細胞信號通路的影響的示意圖； 圖3為小白菊內酯（PTL)對PDLCs細胞炎癥因子和破骨相關因子基因表達的影響的示 意圖； 圖4為小白菊內酯（PTL)對巨噬細胞向破骨細胞分化的影響（TRAP染色結果）的示意 圖； 圖5為小白菊內酯（PTL)對破骨細胞中破骨功能相關基因的影響的示意圖。
【具體實施方式】
[0014] 現結合附圖1至5說明與實施例對本發明進一步說明： 實施例1藥效學試驗：小白菊內酯對牙周細胞炎癥反應和骨質破壞抑制實驗： 具體實驗過程如下： 1、 材料： 1).牙周韌帶細胞（PDLCs)和巨噬細胞： 收集中山大學附屬口腔醫院口腔頒面外科門診患者（18~25歲）因阻生或正畸治療 拔除的健康、完整、無齲恒牙(經患者知情同意后)。刮取牙周組織進行牙周韌帶細胞的原代 培養。
[0015] 采用巨噬細胞Macrophage，g卩RAW264. 7細胞系作為破骨細胞前體，用于本實驗。
[0016] 2).藥物與試劑： ①.小白菊內酯（PTL)，實驗試劑，購自美國Sigma公司。以100%DMS0溶解配制成 20mmol/L的儲存液；使用時以含10%胎牛血清的DMEM培養基(含青鏈霉素雙抗）稀釋至所 需濃度，艮卩1，5，10 and 20 μ M0
[0017] ②.革蘭氏陰性細菌內毒素脂多糖（LPS，E. C〇li055:B5)，購自美國Sigma公司，以 PBS溶液溶解配制儲存液；使用時以含10%胎牛血清的DMEM培養基(含青鏈霉素雙抗)稀釋 至 I Kg/mL 。
[0018] ③.細胞培養液：DMEM低糖培養基，胎牛血清（FBS)購自美國Gibco公司；青鏈霉 素雙抗購自美國Sigma公司。
[0019] ④.TRIzo 1? Reagent :提取mRNA細胞裂解試劑，購自澳大利亞Life Technologies 公司。
[0020] ⑤.DyNAmo ? cDNA Synthesis Kit :逆轉錄試劑盒，購自澳大利亞Life Technologies 公司。
[0021] ⑥.SYBR reagent :QRT-PCR反應試劑，購自美國ABI公司。
[0022] ⑦· TRAP staining assay kit :TRAP染色試劑盒，用于多核破骨細胞的染色，購 自美國Sigma公司。 3).實驗儀器： ①：ABI 7500 Thermal Cycler :QRT_PCR 儀器，澳大利亞 Applied Biosystems 公司。
[0023] ②：酶標儀：美國 Molecular Devices 公司，SpectraMax Microplate Reader 系 列。
[0024] ③：倒置相差顯微鏡！Nikon公司，Nikon ECLIPSE, TSlOO系列。 2、 實驗方法： 1).牙周韌帶細胞和巨噬細胞的培養： 收取牙體組織樣本后，以含5%雙抗（青/鏈霉素）的無菌PBS沖洗3遍后備用；超凈 臺內用手術刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜組織，用眼科剪剪成約Imm3大小的組織塊；收 集組織塊，將組織塊接種于25cm 2培養瓶中，置37°C、5% C02培養箱中培養。7-8h后待組織 塊大部分貼壁后，加入3 mL含10%FBS的DMEM培養基(含青鏈霉素雙抗)，2-3天觀察并換液 1次。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況，當細胞生長達80%融合時，采用胰酶消化法 (0. 25%胰酶+0. 02% EDTA)進行細胞1 :3傳代，取第3~6代細胞進行后續實驗。
[0025] 將巨噬細胞系RAW264. 7置37°C、5% CO2培養箱中培養，細胞培養基為含10%FBS 的DMEM培養基(含青鏈霉素雙抗)，2-3天觀察并換液1次。
[0026] 2) · MTT法檢測小白菊內酯（PTL)對roLCs增殖能力的影響： 取生長良好的第3~5代roLCs，消化后以3 X IO3個/mL密度接種于9塊96孔板，每 塊板30孔，每孔100 μ L，在37°C、5% CO2培養箱培養常規培養12h保證細胞貼壁生長。按 實驗分組更換培養基，PTL濃度分別為0，1，5,10和20 μΜ;繼續培養1，3和7天后，每孔 加入10 yL MTT試劑，37°C孵育4h后，以DMSO溶解生成的formazan。使用酶標儀495nm 加蓋測定各孔OD值，進行統計學分析。
[0027] 3).小白菊內酯（PTL)對PDLCs細胞中NF- κ B信號通路的影響： 本實驗采用Western blot檢測小白菊內酯（PTL)對roLCs細胞中NF-κ B信號通路的 影響。
[0028] 取生長良好的roLCs細胞，消化后以IX IO5個/mL密度接種于6孔板，每孔1.5 mL 細胞懸液，37°C、5% 0)2培養箱常規培養24h保證細胞貼壁生長；以1 μΜ PTL預處理細胞 lh，然后以I Pg/mL Escherichia coli LPS刺激細胞；在LPS加入后，在15, 30和60分 鐘時間點收集細胞全蛋白；細胞裂解液配方是：1% Ipegal，l% sodium dodecyl sulphate， 50 mM Tris-HCl和150 mM