在卵泡同步化后的單劑重組牛fsh的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及使用有生物活性的重組促卵泡激素（rFSH)在非人類哺乳動物中提高 生殖性能的方法和組合物。本發明還涉及使用rFSH在非人類哺乳動物中增加排卵、胚胎產 生或妊娠的方法。本發明尤其可以在人工授精或體外授精程序中用于有蹄類動物例如牛或 馬。
【背景技術】
[0002] 在非人類哺乳動物例如牛、馬或其他有蹄類動物中提高生殖性能的能力，對所有 者來說可以具有顯著利益。這可以通過在這樣的非人類哺乳動物中提高生育力和/或生殖 力來實現。目前，已提出了數種方法或方案來提高生殖性能，它們是基于使用雌二醇和其 他激素例如GnRH (促性腺激素釋放激素）、LH (促黃體激素）、FSH (促卵泡激素）或孕激素 (progestagen)(例如孕酮）來模擬在目標物種中存在的激素的天然或接近天然的水平。一 些這些方案包括在雌性中使排卵同步化的步驟，以便以同步化方式促進卵泡的刺激、生長 和排卵，允許定時人工授精，避免發情期檢測的必要性。這些所謂的同步化方案在全世界被 廣泛用于商業化牛奶場和肉牛牧場。
[0003] 用于使卵泡波的出現同步的最常用處理方法之一，包括使用不同類型的雌激素。 然而，這種留類激素在世界的許多地方不能使用，并且已開發了可替選的方法來控制卵泡 和黃體期，其目的在于例如在雌二醇不可用的國家中改進胚胎供體母牛的超數排卵過程。 一種似乎是有希望的選項的方法是在GnRH誘導的排卵之后，在新的卵泡波出現時啟動FSH 處理。此外，由于目前可用的FSH產品的半衰期一般來說短（約6小時），因此超數排卵方 案包括每日兩次FSH處理，總共4至5日，這是相當耗時、緊張的，并容易發生錯誤。此外， 在目前開發的超數排卵計劃期間的這些頻繁的管理，使其幾乎不可能應用于例如放養在牧 場中的肉牛。因此，標準的超數排卵方法是基于在通常發生在天然存在的發情期后8至12 天的卵泡波出現時多次注射FSH。這種方法被稱為"基于發情期的"，并且它盡管在胚胎產 生方面高效，但取決于發情周期的階段，并需要發情期檢測。較晚的研宄發現，與允許更理 想的從授精到排卵的時間間隔的現代同步化方案相比，在"基于發情期"的程序中生育率明 顯較低。
[0004] 為了確定延長FSH刺激方案是否能夠增加排卵反應，已進行了研宄。作者似乎得 出結論，將FSH注射時間長度從連續4天延長到連續7天，可以維持卵泡生長并導致更多卵 泡獲得排卵能力。更多的研宄正在進行中，以在不同牛品種中驗證這個假說。
[0005] 在另一個已報道的方案中，將母牛用FSH處理3天而不是4天，并且將第4天的最 后兩次注射用2eCG (馬絨毛膜促性腺激素）注射代替（Barros等，2008)。這種處理似乎增 加了胚胎的數目，盡管處理時間仍然長。此外，eCG是相當大的分子，并且已被描述在重復 使用時誘導抗體形成，并且可能限制這些類型的方案的廣泛/頻繁使用。
[0006] 在試圖減少FSH注射的數目的嘗試中，已開發了一種可選替方案，其中將FSH包埋 在緩釋聚合物（透明質酸）中。使用這種緩釋制劑，在"基于發情期"的超數排卵計劃后進 行單次注射。然而，作者得出結論，透明質酸也過于粘稠，并且單次肌內注射產生較低的超 數排卵反應（Bo等，2010)。
[0007] EP2134165提出了一種使用單鏈FSH提高生殖的可替選方法，在所述單鏈FSH中兩 個亞基由肽連接物共價連接，其在發情期后7至13天在單一藥劑中給藥。根據這種方法， 通過鑒定參考發情期（或發情）日期（最后發情的當天）來準備用于FSH注射的動物，然 后在動物周期的第7至8天之間在單次注射中給藥FSH。結果似乎令人滿意，但是需要動物 的個體觀察和監測來確定最有效的處理方式。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明涉及使用有生物活性的重組促卵泡激素（rFSH)在非人類哺乳動物中提高 生殖性能的方法和組合物。本發明還提供了用于在非人類哺乳動物中提高生殖、特別是生 育力和生殖力的改進的方法。
[0010] 更具體來說，本發明提供了改進的基于rFSH的組合物和處理方法，其通過最小化 給藥次數和劑量，在非人類哺乳動物中提供了提高的生殖性能。
[0011] 本發明的具體目的涉及重組rFSH類似物或包含rFSH類似物的組合物，其用于在 經歷卵泡同步化方案和/或處理的非人類哺乳動物中提高生殖性能。更優選地，所述rFSH 類似物在單次給藥中，優選地以約〇. 01 μ g至約5mg之間的劑量范圍給藥。
[0012] 本發明的具體目的涉及重組rFSH類似物或包含rFSH類似物的組合物的用途，其 用于在經歷卵泡同步化方案和/或處理的非人類哺乳動物中提高生殖性能。更優選地，所 述rFSH類似物在單次給藥中，優選地以約0. 01 μ g至約5mg之間的劑量范圍給藥。
[0013] 本發明的另一個目的在于一種rFSH類似物（或包含rFSH類似物的組合物），其用 于在一個或數個非人類哺乳動物中提高生殖性能，其中在卵泡同步化后，將所述rFSH類似 物在單次給藥中，優選地以10 μ g至Img之間的劑量范圍給藥于每個所述一個或數個非人 類哺乳動物。
[0014] 本發明的另一個目的在于一種用于在一個或數個非人類哺乳動物中提高生殖性 能的方法，所述方法包括在卵泡同步化后，優選地以10 μ g至Img之間的劑量范圍向每個所 述一個或數個非人類哺乳動物單次給藥rFSH類似物。
[0015] 本發明的另一個目的是一種用于在一個或數個非人類哺乳動物中誘導超數排卵 的方法，所述方法包括向每個所述一個或數個非人類哺乳動物給藥rFSH類似物，其中所述 rFSH類似物在卵泡同步化方案和/或處理后，在單次給藥中，優選地以10 μ g至Img之間的 劑量范圍給藥于所述非人類哺乳動物。
[0016] 本發明的另一個目的是一種用于在一個或數個非人類哺乳動物中提高排卵率的 方法，所述方法包括向每個所述一個或數個非人類哺乳動物給藥rFSH類似物，其中所述 rFSH類似物在單次給藥中，優選地以10 μ g至Img之間的劑量范圍給藥于所述非人類哺乳 動物。給藥優選地在卵泡同步化之后進行。
[0017] 本發明的另一個目的是一種用于在一個或數個非人類哺乳動物中產生或回收卵 母細胞的改進方法，所述方法包括向每個所述一個或數個非人類哺乳動物給藥rFSH類似 物，其中所述rFSH類似物在單次給藥中，優選地以IOyg至Img之間的劑量范圍給藥于所 述非人類哺乳動物。
[0018] 給藥優選地在卵泡同步化之后進行。這樣的方法對于提高體外授精（IVF)方案或 程序的性能來說特別有利。
[0019] 就此而言，本發明的另一個目的涉及一種體外授精（IVF)方法，所述方法包括從 非人類哺乳動物供體獲得卵母細胞的步驟和在體外對所述卵母細胞進行授精的步驟，其中 通過rFSH類似物的單次給藥，優選地以10 μ g至Img之間的劑量范圍對所述非人類哺乳動 物供體進行處理，以增加卵母細胞生產。給藥優選地在所述非人類哺乳動物供體的卵泡同 步化之后進行。
[0020] 本發明的另一個目的是一種用于在非人類哺乳動物中提高黃體的質量和數量的 方法，所述方法包括向所述非人類哺乳動物給藥rFSH類似物，其中所述rFSH類似物在單次 給藥中，優選地以10 μ g至Img之間的劑量范圍給藥于所述非人類哺乳動物。
[0021] 在特定實施方式中，本發明涉及一種方法，其包括：
[0022] (a)提供經過處理以使卵泡同步化的非人類哺乳動物（例如有蹄類動物）或一組 非人類哺乳動物（例如一組有蹄類動物）；或者對非人類哺乳動物（例如有蹄類動物）或 一組非人類哺乳動物（例如一組有蹄類動物）進行處理，以使卵泡同步化；
[0023] (b)以約0. 01 μ g至約5mg之間的劑量范圍，優選地通過注射、更優選地通過肌內 注射，向所述非人類哺乳動物或一組哺乳動物給藥單劑rFSH類似物；以及
[0024] (c)優選地在排卵時間附近，更優選地在給藥步驟（b)后2至7天、甚至更優選地 4至6天，對所述非人類哺乳動物或一組非人類哺乳動物進行授精，優選地通過人工授精來 進行。
[0025] 這種方法避免了對檢測或監測發情期的需要，并且特別是對于成組非人類哺乳動 物更加有效。
[0026] 在另一種特定實施方式中，本發明涉及一種方法，其包括：
[0027] (a)提供經過處理以使卵泡同步化的有蹄類動物或一組有蹄類動物；或者對有蹄 類動物或一組有蹄類動物進行處理，以使卵泡同步化；
[0028] (b)以約10 μ g至約Img之間的劑量范圍，優選地通過注射、更優選地通過肌內注 射，向所述有蹄類動物或一組有蹄類動物給藥單劑rFSH類似物；
[0029] (C)優選地通過卵泡抽吸從所述有蹄類動物回收卵母細胞；
[0030] (d)任選地，在體外對所述回收的卵母細胞進行授精；以及
[0031] (e)任選地將所述受精的卵母細胞植入到受體動物中，優選地植入到以前通過以 約10 μ g至約Img之間的劑量范圍給藥單劑rFSH類似物進行處理的受體動物中。