一種新型α-葡萄糖苷酶活性抑制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新型a-葡萄糖苷酶活性抑制劑，屬于功能食品的功能因子和藥 物領域。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是一種以血糖過高為主要特征的全球性內分泌系統疾病，其中，II型糖尿 病占到90%以上，降低血糖含量是預防和治療糖尿病的重要途徑。有研宄預測，全球糖尿 病患者將從2000年的1. 71億增加到2030年的3. 66億，發病率居高不下，而發展中國家糖 尿病人數可能會翻倍。國際糖尿病聯合會報告指出，全球每年都有5百萬人死于糖尿病，到 2014年底，用于糖尿病治療費用已逾5. 66千億，因此，預防和治療糖尿病的工作刻不容緩。
[0003] a-葡萄糖苷酶抑制劑通過競爭性抑制或非競爭性抑制小腸刷狀邊緣a-葡萄糖 苷酶的活性，延遲多糖、雙糖轉化為可吸收的葡萄糖，減緩血糖的升高。常見的降糖藥一一 阿卡波糖，米格列醇，伏格列波糖均為化學或半化學合成，雖然有一定的降血糖效果，但臨 床應用中存在胃脹、腹瀉、肝損害等副作用，因此我們需要從自然界中尋找天然副作用少的 葡萄糖苷酶抑制劑。多項研宄報道，茶葉提取物具有防癌抗腫瘤、預防心血管疾病、調節 血糖血脂、預防糖尿病等多種藥理功能，但研宄多集中在茶多酚和蛋白質酪氨酸磷酸酶上。 茶色素是從茶葉中的茶多酚經氧化聚合而成的酚性色素，由茶黃素、茶紅素和茶褐素組成。
[0004] 本發明證明茶色素能夠抑制a-葡萄糖苷酶活性，有很好的預防血糖快速升高的 效果，如果能作為食品添加劑或控糖藥物，將會在糖尿病的防治領域具有良好的應用前景。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種新型a-葡萄糖苷酶活性抑制劑，所述抑制劑是紅茶茶 色素。
[0006] 所述紅茶茶色素包括茶黃素、茶紅素和茶褐素。經測定，醇溶性茶黃素、茶紅素和 茶褐素的IC5tl分別為3. 94yg/ml、3. 24yg/ml、75. 43yg/ml，水溶性茶黃素、茶紅素和茶褐 素的IC5tl分別為8. 19yg/ml、4. 50yg/ml、6. 98yg/ml，無論醇溶性茶色素還是水溶性茶色 素，對a-葡萄糖苷酶的抑制效果遠遠優于阿卡波糖（IC5tl= 1.04mg/ml)。
[0007] 在本發明的一種實施方式中，所述紅茶茶色素是以江蘇宜興紅茶為原料，通過有 機溶劑萃取的方式得到的天然產物，經體外實驗證明對a-葡萄糖苷酶的活性有強烈抑 制，其來源于紅茶，毒副作用少，對a-葡萄糖苷酶的抑制效果遠遠高于目前控制II型糖尿 病的一線藥物拜糖平（阿卡波糖）。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，采取以下步驟獲得所述紅茶茶色素：
[0009] (1)將干燥的紅茶茶葉與80%乙醇按1§:2〇-3〇1^的比例混合，浸泡2411，過濾，濾 液濃縮蒸發乙醇，得到醇提茶色素，醇溶性茶色素提取物用適量的水轉溶；濾渣用60°C熱 水浸提，重復2-3次，合并每次的浸提液，蒸發水分得到濃縮的水提茶色素；
[0010] (2)向上述醇提茶色素中加入等體積的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡堿，保 留水相；向上述水提茶色素中分別加入等體積的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡堿，保 留水相；兩水相分別獨立進行后續提取過程；
[0011] (3)向水相中加入等體積的乙酸乙醋，萃取3次并合并，得到乙酸乙酯相和水相；
[0012] (4)向第（3)步中的乙酸乙酯相加入等體積的2. 5%的似110)3溶液，以除去部分 茶紅素，保留有機相，并用截留分子量為100-500Da的透析袋透析除鹽，然后蒸發有機溶劑 得到茶黃素；
[0013] (5)向第（3)步中的水相加入等體積的正丁醇，萃取3次并合并，得到有機相和水 相，蒸發有機相中的正丁醇即得到茶紅素；
[0014] (6)蒸發第（5)步水相中殘留的正丁醇即得到茶褐素；
[0015] (7)將得到的茶黃素、茶紅素和茶褐素樣品真空凍干，分別得到干燥的醇溶性和水 溶性的茶黃素、茶紅素和茶褐素。
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述紅茶茶葉是宜興紅茶。
[0017] 本發明提供的宜興紅茶中提取的茶黃素、茶紅素和茶褐素三種茶色素能強烈抑制 a_葡萄糖苷酶活性，且這三種茶色素是從茶葉中提取的天然色素，安全無毒，具有常用的 降糖藥物拜糖平所不具備的優勢。通過抑制腸道中糖類的消化酶a-葡萄糖苷酶活性，紅 茶色素將成為功能性食品添加劑或藥劑，在預防和治療糖尿病中發揮作用。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明一種實施方式中提取茶色素的工藝流程圖
【具體實施方式】
[0019] 茶色素對a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用的測定：
[0020] A.測定原理：以無色的對硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷（pNPG)作為反應底物，a-葡 萄糖苷酶水解a-1，4-葡萄糖苷鍵會釋放出對硝基苯酚（PNP)，對硝基苯酚（PNP)在堿性條 件下顯黃色，通過在405nm下測定吸光度的變化間接測定酶活的抑制情況。測定體系如下： 在500yL磷酸鹽緩沖液體系（pH6. 8)中，加入250yLa-葡萄糖苷酶抑制劑和事先溶于緩 沖液中500 1^2臟〇1/1的？咿6,37°〇下預熱51^11，再加€[-葡萄糖苷酶250 1^，371：反應 30min，然后再加ImlNa2CO3終止反應，405nm下測吸光度。
[0021] a-葡萄糖苷酶活性抑制率計算公式：
[0022]
[0023] 為既加酶也加抑制劑時的吸光度；A^ee為加抑制劑不加酶時的吸光度； 為加酶不加抑制劑時的吸光度；A5iffiee為既不加酶也不加抑制劑時的吸光度（其它用緩 沖液補充至相應的體積）。
[0024] B.測定方法：各個物質對a-葡萄糖苷酶的抑制能力用半數抑制濃度（IC5tl)來 衡量，當抑制率為50%時，所對應的抑制劑的濃度即為IC5tl。將凍干后的醇溶性和水溶性 茶黃素、茶紅素和茶褐素用蒸餾水配成25yg/ml、20yg/ml、10yg/ml、5yg/ml、2. 5yg/ ml、lyg/ml，陽性對照阿卡波糖用蒸餾水配成濃度為5mg/ml、2. 5mg/ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、 0.lmg/ml的濃度梯度，按上述測定體系測定每個稀釋濃度對a-葡萄糖苷酶的抑制能力， 并計算IC5(I。
[0025] 實施例1茶色素的提取
[0026]干燥的宜興紅茶茶葉：體積濃度為80%的乙醇=1:20-30(g:mL)，浸泡24h，過濾， 濾液濃縮蒸發乙醇后用水轉溶，得到醇提茶色素；濾渣用60°C熱水浸提2h，重復2-3次，合 并每次的浸提液，蒸發水分得到濃縮的水提茶色素。向醇提茶色素和水提茶色素中分別加 入等體積的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡堿，保留各自的水相，分別用于后續提取步 驟。
[0027] 向水相中加入等體積的乙酸乙酯，萃取3次并合并乙酸乙酯相，得到乙酸乙酯相 和水相。
[0028] 對上一步得到的乙酸乙酯相，向乙酸乙酯相加入等體積的2. 5%的似110)3溶液，保 留有機相，用截留分子量為100_500kDa的透析袋透析除鹽，并蒸發有機溶劑得到茶黃素樣 品。對上一步得到的水相，向水相中加入等體積的正丁醇，萃