異源造血干細胞移植的增強的制作方法
【專利說明】異源造血干細胞移植的增強
[0001] 本申請是在2013年8月9日提交的申請號為201280008500. 9的發明名稱為"異 源造血干細胞移植的增強"的專利申請的分案申請。
[0002] 政府權利
[0003] 本申請在國立衛生研宄院（NationalInstitutesofHealth)給予的政府支持 下做出（批準號為CA49605)，并且還獲得了白血病和淋巴瘤學會（Leukemiaand淋巴瘤 Society)給予的支持（批準號為6038-09)。
【背景技術】
[0004] 癌癥也被稱為惡性腫瘤，其特征為表現為不受控細胞分化的細胞的異常生長、侵 襲和破壞臨近的組織、并且有時轉移至體內的其他位置。存在超過100種類型的癌癥，包括 乳腺癌、皮膚癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌和淋巴瘤。在美國，癌癥是導致死亡的第二大主要 原因，所有死亡的約13%是由癌癥導致的。癌癥會影響所有年齡段的人，甚至胎兒，但大多 數類型癌癥的風險隨年齡增加。癌癥能夠影響所有的動物。
[0005] 化療已經成為許多癌癥的標準治療方法。化療是指使用抗腫瘤藥物來治療癌癥或 將這些藥物結合到細胞毒素標準化治療方案中。最常用的是，化療通過殺死快速分化的細 胞（這是癌細胞的主要特性之一）而起作用。這種方法也會傷害在正常情況下快速分化的 細胞：骨髓、消化道和毛囊中的細胞；這會導致的最常見的副作用是化療-骨髓抑制（血細 胞產生減少）、粘膜炎（消化道內襯發炎）和禿頭癥（脫發）。新的抗癌藥物直接對癌細胞 中的異常蛋白起作用；這被稱為靶向治療。
[0006] 異源造血細胞移植（HCT)能夠用于對患有白血病和淋巴瘤的患者進行治療，尤其 是當移植時接受治療的患者處于完全緩解（completeremission)狀態時。然而，如果接 受治療的患者在移植時處于部分緩解狀態，或者當采用非清髓性處理（non-myeloablative conditioning)時發生混合嵌合而不是完全嵌合，則進行性疾病和復發的風險相當大。
[0007] 盡管出現了這些新的藥劑和改進的組合，但目前的治療方法對于許多類型的癌癥 或不同階段的癌癥仍然是無效的。對于癌癥治療非常需要改進的治療方案和治療方法。
【發明內容】
[0008] 在本發明的一種實施方式中，提供了用于在異源造血細胞移植（或異基因造血細 胞移植）之后通過加入純化的供體淋巴細胞亞群來促進癌癥（包括但不限于白血病和淋巴 瘤）治療的組合物和方法，該供體淋巴細胞亞群能夠殺死腫瘤細胞而不引起移植物抗宿主 病（GVHD)的主要并發癥。
[0009] 在一種相關的實施方式中，提供了在異源造血細胞移植（HCT)之后增強混合的造 血細胞嵌合向完全供體細胞嵌合轉化的方法和組合物，其中這樣的移植可被用于治療癌癥 或需要重建造血系統的其他病癥，例如用于治療貧血癥、地中海貧血、自身免疫病等。混合 嵌合與比通過隨后的異源HCT達到完全供體嵌合的患者高得多的癌癥發展或復發率相關。 盡管在移植后的時間點可常規地進行供體淋巴細胞輸注（DLI)，但DLI通常由血液中含有T 細胞全部亞群的外周血單核細胞構成，因此會帶來引起嚴重GVHD的主要風險。
[0010] 本發明通過利用基本上純的供體記憶性⑶8+T細胞的組合物作為異源HCT之后的 DLI來改善常規DLI，其中在人類中進行移植后的適合時間給予該細胞，例如從約2個月至 約6個月，以防止腫瘤復發，或在腫瘤復發時候給予該細胞以治療該復發。該方法提供了更 完全的供體嵌合，并且具有殺死腫瘤細胞的進一步益處。該記憶性CD8+T細胞可包括中樞 記憶性T細胞和效應記憶性T細胞中的一種或兩種，通常包括二者。該供體記憶性T細胞 通常是純化的，并且可以單獨利用特異于CD8的親和性試劑或與本領域已知的這種細胞的 其他標志物（包括但不限于⑶8+⑶44+群）的組合來進行選擇。以對于促進完全嵌合有效 的劑量給予該T細胞，并且在適當的時候，增強腫瘤細胞的殺滅。
[0011] 在一些實施方式中，癌癥是實體瘤。能夠利用本發明所述的方式治療的實體瘤的 實例包括，但不限于，結腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和卵巢癌。在其他 實施方式中，癌癥為白血病或淋巴瘤，包括但不限于，急性淋巴細胞白血病（ALL)、急性髓性 白血病（AML)、慢性髓性白血病（CML)、淋巴瘤（如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤）等。在 一些實施方式中，腫瘤細胞為原發瘤或轉移瘤。
【附圖說明】
[0012] 所附權利要求書特別地描述了本發明的新特征。通過參照以下描述了其中利用了 本發明的原則的示例性實施方式的詳細說明和附圖將更好地理解本發明的特征和優勢。
[0013] 圖1.用供體C57BL/6T⑶BM細胞移植的、具有或不具有總T細胞或T細胞亞群 的BALB/c宿主的存活。A，致死性輻照（800cGy)宿主給予來自供體的2X106TCDBM細胞， 具有或不具有（N= 12)來源于脾臟的0. 5XIO6分選的供體總T(N= 10)或總⑶4+T(N= 10)細胞。從兩次獨立實驗收集數據。B，從圖A中確定小鼠體重的連續測量值。+當組中 的僅剩不超過兩只小鼠時停止體重測量。C，在輻照后6小時使宿主接受500BCL^#巴瘤細 胞。向經致命性輻照的宿主給予2XIO6T⑶BM細胞，具有或不具有（N= 8)0. 5XIO6分選 的0)62^0)441°初始（N= 10)或CD44hH己憶性表型CD4 +T細胞（N= 10)。也向對照未處 理宿主給予腫瘤細胞（N= 8)。從兩次獨立實驗收集數據。D和F，示出了在僅T⑶BM移植 或分別與記憶性CD4+T細胞或記憶性總T細胞移植28天后，分別在C和E中來自具有進行 性腫瘤生長的受體的外周血中的⑶19與BCI^個體基因型標志物的代表性雙色流式細胞分 析。
[0014] 圖2.初始表型⑶8+T細胞和記憶性表型⑶8+T細胞的表征。A，用抗-⑶8、抗-⑶44 和抗-⑶62LmAbs對C57BL/6脾細胞進行染色。分析門控⑶62Lhira44lQW和⑶44hkD8+T的 CCR9、a40 7，、⑶122和CXCR3表達。通過同型染色來確定門。對于⑶441°⑶8+T細胞（粗 線）和⑶44hira8+T(彩色區域），各標志物的柱狀圖重疊。B，在MLR的第5天在三個平行孔 中每一次細胞混合的C57BL/6應答初始表型⑶8+T細胞或記憶性表型⑶8+T細胞（2XIO5) 與BALB/c刺激細胞（8XIO5)的3H-胸苷結合（平均值土SE)。結果為至少3次MLR試驗的 代表性結果。Allo和Syn分別表示BALB/c和C57BL/6刺激細胞。+表示3H-胸苷結合小于 5,OOOcpm。C，在MLR中第60小時示出了C57BL/6供體初始表型CD8+T細胞和記憶性表型 ⑶8+T細胞（IXIO5)對經輻照的BALB/c刺激細胞（5XIO5)的細胞因子反應。左圖示出了 IL-2的平均值土SEM濃度；右圖示出了IFN-y的平均值土SEM濃度。#，細胞因子的濃度 為〈10pg/ml。結果是至少三次MLR培養的代表性結果。D，分選的初始細胞（naivecells) 和記憶性細胞被用于針對表達的熒光素酶-BCL1細胞的細胞毒性實驗。用經輻照的BALB/c 脾細胞刺激分選的初始或記憶性表型CD8+T細胞96小時。將表達熒光素酶的BCL1淋巴瘤 細胞與經刺激的初始或記憶性表型細胞以不同的效應細胞：靶細胞比率混合。在16小時 后測量熒光素酶信號。然后與在每一時間點無效應細胞的相同靶細胞數目相比較來確定細 胞毒素百分比。
[0015] 圖3.接受移植的供體C57BL/6TCDBM細胞、具有或不具有分選的、總的、初始或記 憶性表型CD8+T細胞的BALB/c的受試者的存活和體重變化。A和C，示出了從具有或不具 有I.OXIO6初始、I.OX10 6記憶、0? 5X10 6初始、0? 5X106 記憶或 0? 5X10 6總CD8 + 供體T 細胞（N= 8-11)的供體給予2XIO6T⑶BM細胞的經致死輻照的BALB/c宿主的存活。從 兩個獨立的實驗收集數據。B和D，如在A和C中給予具有或不具有分選的初始、記憶或總 CD8+T細胞的TCDBM的宿主小鼠的初始體重半分比。括號示出了平均值的SE。
[0016] 圖4.接受了 500BCQ淋巴瘤細胞之后移植來自C57BL/6供體的T⑶BM、包含或 不包含分選的初始、或記憶性、或總CD8+T細胞的BALB/c宿主的存活、體重變化和器官病 理學評分。該宿主在輻照后6小時接受SOOBCL1淋巴瘤細胞。A，被給予包含或不包含（N =10)0. 5XIO6分選的初始（N= 14)、記憶性（N= 12)、或總CD8 +T細胞（N= 10)的來自 C57BL/6供體的2XIO6T⑶BM細胞的經輻照宿主的存活。從2-4次獨立實驗收集數據。B，如 A中被給予包含或不包含分選的初始、記憶性或總CD8+T細胞的TCDBM的宿主小鼠的初始 體重百分比。括號示出了平均值的SE。C，僅由初始、記憶性表型、或總⑶8+T細胞和T⑶BM 誘發的組織病理學變化。代表性組織切片獲自A中的宿主。在移植后100天從宿主的肝臟 和大腸獲得組織病理學樣本，并在福爾馬林中固定，之后包埋在石蠟塊中。用蘇木精和曙紅 對厚度為4-5mm的組織切片進行染色。利用EclipseE1000M顯微鏡（Nikon,Melville,NY) 用SPOTRT數字攝像機和獲取軟件（DiagnosticInstruments,SterlingHeights,MI)獲得 顯微鏡圖像，全部圖像的最終放大倍率為300倍。利用PhotoshopCS(Adobe,SanJose,CA) 以標準調節的量度、對比度和色平衡對圖像進行處理以獲得完整圖像。在TCDBM組中在第 21天進行組織病理學分析（上圖）。除了罕見的細胞凋亡（箭頭，左側照片）之外，在結腸 中沒有發生GVHD的證據，而在肝臟中淋巴瘤是明顯的（箭頭，右側照片）。在初始細胞組中 (第二行照片），在結腸中沒有發生GVHD的證據。肝臟匯管具有顯著的淋巴細胞浸潤，這與 2級GVHD-致（星號（asterix)，右側照片）。在記憶性細胞組（第三行照片）中，在結腸 或肝臟中均沒有GVHD或淋巴瘤的證據。在具有總⑶8+T細胞的T⑶組中，在結腸隱窩（箭 頭）中觀察到細胞凋亡增加以及固有層發炎增加（開箭頭，第四行左側照片）。類似地，在 肝臟中觀察到肝門發炎和膽管損傷（星號），這與GVHD-致。用H&E對組織切片進行染色。 每一幅照片代表所檢查的5-10個宿主。D，來自四個組（N= 6/組）的肝臟、小腸和結腸的 組織病理學GVHD評分的平均值（土SE)。NS=不顯著（p>0. 05)。
[0017] 圖5.在移植T⑶BM并且結合或不結合分選的初始或記憶性⑶8+T細胞之后，BCLl 腫瘤細胞的存活、嵌合和清除。A，在全身輻照（TBI，800cGy)、BCL1細胞、以及包含或不包含 初始或記憶性表型CD8+T細胞的2XIO6TCDBM骨髓細胞移植后的28天來自受體的外周血 中的⑶19與BCI^個體基因型標志物的代表性雙色流式細胞分析。向未處理的對照受體僅 給予BCL1。盒中封入BCL1個體基因型+⑶19+細胞，并示出了盒中細胞的百分比。B，在第28 天的外周血的代表性流式細胞分析示出了門控TCRfT細胞中的供體（H-2Kb+)細胞百分比。C和D，被給予來自C57BL/6供體的包含或不包含（N= 8) 0? 5X106、0.IXIO6或0? 05X10 6 分選的初始（N= 15;N= 9;N= 8) (C)或記憶性表型表型（D)CD8+T細胞（N= 12;N= 9 ; N= 8)的2XIO6T⑶BM細胞的經致命性輻照BALB/c宿主的存活。從兩次單獨實驗收集數 據。
[0018] 圖6.熒光素酶基因改造的初始和記憶性⑶8+T細胞在移植非基因改造T⑶BM 之后的運輸和增殖的比較。BALB/c宿主經致死性輻照，接受500BCU淋巴瘤細胞，然后 注射具有來自B6-L2G85 (H-2b)Iuc+小鼠的0. 5X10 6