N-(苯基氨基硫代甲酰基)苯甲酰胺類化合物的新用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，涉及一類小分子化合物的醫藥應用，具體涉及N-(苯 基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類化合物或其可藥用鹽在制備用于治療與MIF相關的炎癥性 疾病的藥物，特別是MIF抑制劑中的用途。
【背景技術】
[0002] 巨細胞移動抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一 種集細胞因子、酶活性、神經內分泌激素于一身的多功能蛋白質。作為一種細胞因子，MIF 幾乎參與所有炎癥性疾病過程，它通過活化巨噬細胞和T細胞來促進先天性和獲得性免疫 響應，是先天性免疫系統的重要調節因子，被認為是連接內分泌系統和免疫體系的介導劑。 MIF與多種免疫性和炎癥性疾病的發病機制密切相關，如MIF在單核/巨噬細胞的血管壁粘 附、跨膜移動、內皮下聚集、泡沫細胞形成及斑塊穩定中的作用，涉及到類風濕性關節炎、動 脈粥樣硬化發生和發展的多個方面。MIF還直接影響正常細胞的分裂和瘤基因誘導的惡性 轉化，或間接通過調節機體免疫反應，促進細胞增殖、迀移以及血管增生等。
[0003] 由于具有廣泛的生物活性，MIF與多種免疫、炎癥以及腫瘤等疾病密切相關，已經 成為治療這些疾病的一個重要靶點。在與MIF相關的抗炎藥物研宄方面，國外許多醫藥公 司和科研機構正在開發新的具有抗炎效果的MIF抑制劑，但目前還沒有成功上市的MIF抑 制劑。因此，積極尋找和設計新的MIF抑制劑，并探索其抗炎效果，具有重要的臨床意義和 廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0004] 針對上述情況，本發明提供了N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類化合物或其 可藥用鹽在制備用于治療與MIF相關的炎癥性疾病的藥物中的用途，其中所述N-(苯基氨 基硫代甲酰基）苯甲酰胺類化合物具有如式I所示的結構：
其中： R1為氫或鹵素； R2為氫、鹵素、甲基或甲氧甲酰基； R3為氫、鹵素、甲基、異丙基、甲氧甲酰基、苯氧基甲基、三氟甲基、苯基、3, 5-二氟苯基、 3, 5-二氯苯基或3, 5-二三氟甲基苯基； R4為氫、鹵素、甲基、甲氧基或甲氧甲酰基； R5為氫、鹵素、乙酰基、羧基或羥甲基； R6為氫、羥基、羧基、乙酰基、乙酰氨基、甲氧甲酰基、乙氧甲酰基、氨基甲酰基或苯甲酰 氨基； R7為氫或羧基。
[0005] 優選的，在上述技術方案中，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類化合物選 自化合物中的任意一種。
[0007] 優選的，在上述技術方案中，所述可藥用鹽包括(但不限于)N-(苯基氨基硫代甲酰 基）苯甲酰胺類化合物(特別是化合物I^I4C1)與鹽酸、磷酸、硫酸等無機酸形成的酸加成鹽 以及與醋酸、馬來酸、枸櫞酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富馬酸、酒石酸等有機酸形成的酸加成 鹽。
[0008] 優選的，在上述技術方案中，所述與MIF相關的炎癥性疾病包括(但不限于)類風濕 性關節炎、動脈粥樣硬化和敗血癥。
[0009] 優選的，在上述技術方案中，所述用于治療與MIF相關的炎癥性疾病的藥物為MIF 抑制劑。
[0010] 本發明對上述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類化合物進行了生物學活性 測定，發現其對MIF具有明顯的酶抑制活性，對小鼠腹腔巨噬細胞RAW264. 7中的糖皮質激 素具有負向調節效果，可以顯著抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)誘導的炎性因子 (TNF-a和NO)的釋放，這些化合物還可以抑制MIF引起的巨噬細胞的趨化迀移。此外， MTT法檢測證實這些化合物在10、20和40yM三個濃度下對小膠質細胞BV-2和巨噬細胞 RAW264. 7的活力均沒有顯著影響。在此基礎上，進一步研宄化合物抗炎作用是否與抑制 MIF對ERK1/2的活化有關，發現這些化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化。
[0011] 本發明中的N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類化合物具備MIF抑制劑的功 能，對與MIF相關的炎癥性疾病具有明顯的抑制作用，可以用于制備與MIF相關的抗炎藥 物。
【附圖說明】
[0012] 圖1為實施例1中化合物15、18、113和Ii^MIF的酶抑制活性曲線，其中上述化 合物15、18、1 13和I15依次對應圖中的（a)、（b)、（c)和（d)。
[0013] 圖2為實施例2中化合物15對MIF引起的巨噬細胞趨化迀移的影響效果圖。
[0014] 圖3為實施例3中化合物15對培養細胞的敏感性效果圖。
[0015] 圖4為實施例4中化合物15、18、113和I15對小膠質細胞中LPS誘導炎性因子的影 響效果圖。
[0016] 圖5為實施例5中化合物15對MIF刺激的RAW264. 7巨噬細胞中ERK活化的影響 效果圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面將結合附圖及具體實施例對本發明做出進一步的描述。
[0018] 實施例1 :化合物對MIF的酶抑制活性實驗。
[0019] 實驗原理：MIF具有多巴色素互變異構酶活性，可以將橙色的D，L型多巴色素甲 醋轉化為無色的11引噪衍生物，吸光度采用TecanInfiniteM1000酶標儀在475nm波長下 進行3分鐘吸光度測試。
[0020] 實驗試劑的準備：脂多糖(大腸桿菌血清型〇55:B5)、（L)-3, 4-二羥基苯丙酮酸甲 酯和高碘酸鈉購買自西格瑪奧德里奇(美國密蘇里州東部城市圣路易斯）；（S，R) -3- (4-羥 苯基）-4, 5-二氫-5-異惡唑乙酸甲酯（IS0-1)為MIF的典型抑制劑，購買自德國Merck公 司旗下的生化試劑品牌Calbiochem公司，在這里作為陽性對照；將化合物溶解在IOmM的 DMSO儲備溶液中，最后在緩沖液中DMSO的濃度低于0. 25%情況下，將RAW264. 7巨噬細胞 在37°C條件下添加5%熱滅活胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS)，慶大霉素（50g/ml)和 5%(1)2的達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)中生 長和維持，重組人類MIF在大腸桿菌中表達，并且進行純化。
[0021] 實驗步驟：為了制備（L)-多巴色素甲醋，將等體積L-3, 4-二羥基苯甲基丙氨酸甲 酯（4mM)和高碘酸鈉（IOmM)混合，并且在室溫下培養3~5分鐘，然后將（L)-多巴色素甲酯 (30yL)添加到包含重組人類MIF(120nM)和IOmM磷酸鉀緩沖液的96孔板中，另外添加 0. 5mMEDTA并保持pH=6. 2。為了測試化合物對MIF互變異構酶活性的抑制效應，將濃度為 1、 5、10、25、50和100yM的化合物分別添加到包含重組人類MIF( 120nM)的96孔板中，在添 加（L)-多巴色素甲酯之前培養30分鐘，將孔板中的氣泡去掉，采用TecanInfiniteMlOOO 酶標儀在475nm波長下進行3分鐘吸光度測試。
[0022] 實驗結果：將濃度為1、5、10、25、50和100 11|1的^(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲 酰胺類化合物進行MIF的酶抑制活性實驗，發現大多數化合物具有較好的抑制活性，其半 抑制濃度TIC5tl見表1，其中化合物15、18、1 13和I15的11(：5(|曲線圖參見圖1。
[0023] 表1.化合物對MIF互變異構酶的抑制活性（TIC5tl)以及TIC5Q〈10yM的化合物對 LPS誘導的RAW264. 7巨噬細胞分泌NO的影響（NIC5tl)
[0024] 對LPS誘導的RAW264. 7巨噬細胞分泌NO的影響（NIC5tl) [0023]實施例2 :化合 物對MIF引起的巨噬細胞趨化迀移的影響。
[0025] 實驗原理：MIF對巨噬細胞有趨化迀移作用，抑制劑作用于MIF，可以在一定程度 上抑制MIF引起的巨噬細胞的趨化迀移。
[0026] 實驗步驟：將重組人類MIF在添加或者缺失MIF互變異構酶抑制劑的情況下，分別 置于CM-16板的下室，然后在上室將RAW264. 7巨噬細胞接種于包含20000個細胞的無血 清培養基中。