共遞送納米載體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種共遞送藥物和基因的納米載體，具體涉及一種同時荷載基因和治 療藥物的靶向遞藥系統，本發明遞藥系統能夠靶向靶細胞，并遞送基因和藥物到達胞內作 用位點，達到協同治療的目的，屬于藥物制劑技術領域。
【背景技術】
[0002] 將藥物與基因通過高分子納米載體共同包載，共同遞送到靶細胞，一方面緩慢釋 放藥物，另一方面表達治療基因，達到互相促進的作用，可實現藥物治療與基因治療的協同 作用，從而增加療效，是治療腫瘤等惡性疾病理想方法。
[0003] 小分子多胺是基因傳遞的優良載體，但是其分子量小，壓縮核酸的能力有限，因此 有必要將其合成聚合物。精胺（spermine，SPE)是多胺小分子的典型代表。它存在于所有 的真核細胞內，在細胞內代謝中發揮一定的作用，是很好的生物相容性的材料。而且SPE 具有四個胺基，分別是兩個仲胺和兩個伯胺。這些胺基可以與丙烯酸酯基通過邁克爾加 成反應生成具有高緩沖能力的聚精胺（polyspermine，pSPE)。另外，聚乳酸-羥基乙酸共 聚物（PLGA)，是可生物降解的一類聚合物，具有良好的生物相容性，作為藥用輔料已獲得 美國FDA批準。通過對該聚合物末端的羧基進行改性，嫁接聚精胺，制備成兩親性聚合物 pSPE-PLGA，其中pSPE含有大量的仲氨基，荷正電，能很好的載帶負電荷的基因，內核PLGA 作為疏水性材料能很好的裝載難溶性藥物，且具有緩釋、粒徑大小可控等優點。聚精胺PSPE 在體內亦可生物降解，該代謝產物是體內大量存在的內源性物質。因此，pSPE-PLGA具有很 好的生物相容性，是一種無毒、可實現基因和藥物共傳遞的理想載體。在PSPE-PLGA嫁接帶 靶頭的PEG，在隱形材料PEG和靶頭共同作用下可以實現更好的靶向藥物傳遞。
【發明內容】
[0004] 目的：本發明提供一種共遞送藥物和基因的納米載體，該遞藥系統是可用于協同 治療惡性腫瘤或其他惡性疾病如肝纖維化、肝硬化等的治療藥物和基因共遞送納米給藥系 統，涉及一種自組裝形成共載藥物和基因的納米共遞送系統，本發明的自組裝納米遞送系 統能夠將藥物和基因同時遞送到靶細胞內，在靶細胞胞質釋放基因及藥物。
[0005] 技術方案：為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：
[0006] 一種共遞送納米載體，由載治療藥物的聚合物載體PLGA-pSPE-PEG-Ligand自組 裝而成的納米粒與治療基因形成復合物，形成共遞送藥物與基因納米載體；
[0007] PLGA-pSPE-PEG-Ligand為一種非病毒兩親性的陽離子聚合物，由兩親性 PLGA-pSPE與一端羧基一端靶頭的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段組成的聚陽離子 載體，聚合物載體PLGA-pSPE-PEG-Ligand的化學結構式如下：
[0008]
[0009]其中，PLGA分子量為2-100k;pSPE分子量為2-100k;PEG分子量為I-IOk;Ligand 為靶頭，選自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、維生素A(Va)、葉酸（FA)、透明質酸（HA)。
[0010] Ligand為革E頭，聚乙二醇PEG，pSPE為polyspermine聚精胺，聚乳酸-羥基乙酸 共聚物（PLGA)。
[0011] 所述的共遞送納米載體，制備方法包括以下步驟：應用反相溶劑法，將治療藥 物與PLGA-pSPE-PEG-Ligand共溶于溶劑中，逐滴滴加到一定體積去離子水中，用截留 分子量500-14000的透析帶在4 °C下透析2d除去溶劑，得包封治療藥物的聚合物載體 PLGA-pSPE-PEG-Ligand自組裝而成的納米粒；然后將治療基因溶液在渦旋下加入到等體 積的載有治療藥物的PLGA-pSPE-PEG-Ligand納米膠體溶液中，渦旋30s，室溫靜置30min， 即得。可適用于靜脈注射給藥、皮下給藥、粘膜給藥等。
[0012] 所述溶劑為有機溶劑，選自無水DMSO(二甲基亞砜）、甲醇、乙醇中的一種或幾種； 和/或，所述治療藥物為阿霉素、紫杉醇、喜樹堿、水飛薊賓。
[0013] 所述治療基因為DNA或siRNA;其中，DNA為p53、HGF、Akt、PDCD;siRNASsiBcl-2、 siAkt、siTGF-0 1、siHSP47、siTMP-l。
[0014] 作為優選方案，所述的共遞送納米載體，其特征在于：若用于治療肝纖維化，所述 DNA為HGF，siRNA為siTGF-0 1、siHSP47、siHMP-1;所述治療藥物為水飛薊賓；所述靶頭 為甘露糖-6-磷酸（M6P)、維生素A(Va)。若用于治療肝癌，所述DNA為p53、Akt、H)CD，siRNA 為siBcl-2;所述治療藥物為阿霉素、紫杉醇、喜樹堿等。所述靶頭為半乳糖（Gal)、透明質 酸（HA)等。
[0015]本發明提供一種聚合物載體PLGA-pSPE-PEG-Ligand，PLGA-pSPE-PEG-Ligand為 一種非病毒兩親性的陽離子聚合物，由兩親性PLGA-pSPE與一端羧基一端靶頭的聚乙二醇 PEG(HOOC-PEG-Ligand)三段組成的聚陽離子載體，聚合物載體PLGA-pSPE-PEG-Ligand的 化學結構式如下：
[0016]
[0017] 其中，PLGA分子量為2-100k;pSPE分子量為2 -100k;PEG分子量為I-IOk; Ligand為祀頭，選自甘露糖-6-磷酸（M6P)、半乳糖（Gal)、維生素A(Va)、葉酸（FA)、透明質 酸（HA)〇
[0018] 所述的聚合物載體PLGA-pSPE-PEG-Ligand，由精胺（spermine)與聚乙二醇 二丙烯酸酯（PEGDA)通過邁克爾加成反應合成兩端精胺的聚精胺pSPE，pSPE與聚（乳 酸-乙醇酸）共聚物PLGA通過氨基與羧基的縮合反應生成PLGA-pSPE，PLGA-pSPE與一 端羧基一端靶頭的聚乙二醇PEG(HOOC-PEG-Ligand)通過氨基與羧基的縮合反應生成 PLGA-pSPE-PEG-Ligand;聚合物載體PLGA-pSPE-PEG-Ligand的合成方法如下：
[0019]
[0020] 其中，n、x、y、z為正整數。
[0021] 聚合物載體PLGA-pSPE-PEG-Ligand，其制備方法具體包括以下步驟：
[0022] DpSPE的合成：以聚乙二醇二丙稀酸醋（PEGDA)和多胺分子spermine為結構單 元，交替連接成聚合物PSPE，將精胺（SPE)溶解于重量體積比10-20倍量的溶劑中，聚乙二 醇二丙烯酸酯（PEGDA)溶解于重量體積比10-20倍量的溶劑中，SPE與PEGDA的摩爾比例 為I:1-1. 5 :1，然后將I3EGDA溶液慢慢滴加到SPE溶液中，然后在4-100°C下攪拌12-48h; 所得產物溶解于4°C的去離子水中，然后用截留分子量2000-14000的透析帶在4°C下透析 2d;最后將產物凍干，即得pSPE，保存在-20°C下備用；
[0023] 2)PLGA-pSPE合成：取適量PLGA溶于溶劑，加入DCC和NHS，室溫下攪拌反應 0. 5-24h，離心除去沉淀，上清液與含pSPE的無水DMSO溶液混合，pSPE與PLGA的摩爾比例 為I:1-1.5 :1，室溫下攪拌反應12-48h用分子量截留值2000-14000的透析袋在4°C下透 析，得PLGA-pSPE;
[0024] 3)PLGA-pSPE-PEG-Ligand合成：取適量HOOC-PEG-Ligand，溶劑溶解，加入DCC(二 環己基碳二亞胺）和NHS，室溫下攪拌反應0. 5-24h，離心除去沉淀，上清液與含PLGA-pSPE 的無水DMSO溶液混合，室溫下攪拌反應12-48h，用分子量截留值2000-14000的透析袋在 4°C下透析，得PLGA-pSPE-PEG-Ligand。所述溶劑為有機溶劑，選自無水DMS0、甲醇、乙醇中 的一種或幾種。
[0025] 一種上述的HOOC-PEG-Ligand，其結構式如下：
[0026]
[0027]其中，PEG分子量為Ik-IOk;連接鍵為酯鍵或酰胺鍵。
[0028] 所述的HOOC-PEG-Ligand，當Ligand為甘露糖-6-磷酸（M6P)，即HOOC-PEG-M6P， 合成路線如下
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[0030] 所述H00C-PEG-M6P的制備方法具體包括以下步驟：取適量H00C-PEG-C00H，先 用無水DMSO溶解，然后加入DCC和NHS，室溫下攪拌反