高純度和優異產量的正確折疊的依那西普的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明通常涉及用于純化重組表達的蛋白質的層析分離方法，和從該方法得到的 產物。更具體地，本發明涉及使用混合模式的層析法以純化重組蛋白表達產物，包括，例如， 可能包括不期望量的非正確折疊的和/或聚集的蛋白質和適當折疊的蛋白質的融合蛋白。 本發明的混合模式層析方法特別有用于從不正確折疊的依那西普（如本文所定義的）中分 離正確折疊的依那西普。本發明也涉及依那西普制備物和藥物制劑，其中已使用本公開的 方法高產率和高純度地制備供應其中的依那西普。本發明進一步涉及采用高純度的以非常 低水平的錯誤折疊的/聚集的蛋白質為特征的依那西普治療TNF病況的方法。
【背景技術】
[0002] 依那西普（Enbrel?，Immunex Corporation制造）是由與人類免疫球蛋白 G( "IgGl"）的Fc受體[片段，可結晶的]區域連接的人類75千道爾頓（p75)腫瘤壞死因 子受體（"TNFR"）的細胞外配體結合部分組成的二聚融合多肽。依那西普由934個氨基 酸組成并具有約150千道爾頓的表觀分子量（Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.)。依那西普的Fe成分包含重鏈恒定結構域2 (CH2)、重鏈恒定結 構域3 (CH3)和鉸鏈區，但不包括人類IgGl的重鏈恒定結構域I (CHl)。一個Fc域可包括一 個或所有的上述域。
[0003] 患有一些類型的炎性疾病例如風濕性關節炎、斑塊狀銀肩病、銀肩病關節炎、幼年 特發性關節炎和強直性脊柱炎的人具有過度產生腫瘤壞死因子（"TNF"）的免疫系統。已 發現施用依那西普對治療一些炎性疾病是有效的，因為它可通過作為誘餌受體結合TNF而 降低受試者中活化型TNF的水平。
[0004] 可通過重組DNA技術在中國倉鼠卵巢（"CH0"）的哺乳動物細胞表達系統中以已 知的方式產生依那西普。不幸的是，由CHO細胞產生的產物包含大量的不正確或錯誤折疊 和/或聚集的依那西普。對于藥物應用，需要提供相對沒有不正確折疊的和聚集的蛋白質 的依那西普，因為所述不正確折疊的/聚集的蛋白質將不具有與正確折疊的蛋白質相同的 治療效果，且可能實際上對患者是有害的。
[0005] 錯誤折疊和聚集經常發生在產生重組蛋白的過程中，并因此必須通過能夠從錯誤 折疊或聚集的蛋白質中分離正確折疊的蛋白質的下游過程進行處理。錯誤折疊減少或消除 蛋白質的治療效果。通常被理解為涉及兩種或更多種依那西普同源二聚體的非共價聯合以 形成非常高分子量物種的聚集導致相似的治療效果的損失，且當蛋白質（包括錯誤折疊的 蛋白質）積累并聚在一起時，聚集發生。如上所述，這樣的錯誤折疊的蛋白質和蛋白質聚集 體不僅是治療無效的，也可能是對患者有害的。相應地，純化含依那西普的蛋白質表達產物 以使適當折疊的依那西普從錯誤和/或積聚的依那西普中分離的能力對于得到提供最高 可能程度的藥物可接受性的依那西普是重要的。
[0006] 錯誤折疊和聚集的蛋白質的產生不是特定于依那西普的問題。具有許多治療性蛋 白質，對其來說錯誤折疊可能是一個問題。例如，在來自大腸桿菌包涵體的重組蛋白重折疊 的過程中，含二硫化物的蛋白質的錯誤折疊是難以避免的，但其可通過高分辨率的反相色 譜法而被有效分離。然而，在反相色譜法中低pH和有機溶劑的使用在色譜分析過程中可使 蛋白質變性并可能引起純化的蛋白質的聚集。
[0007]即使當錯誤折疊被認為在制備藥物蛋白質中是可忽略的時，例如在哺乳 動物分泌性表達的情況下，仍可能發生聚集和一些錯誤折疊（參見，例如，Chi，E. Y.,Krishnan,S. , Randolph, T. W. and Carpenter, J. F. , Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution:Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation,Pharm.Res.,20, 1325-1336 (2003) ；Kiese,S.,Pappenber ger,A.,Friess, W. , and Mahler,H. C. , Shaken, Not Stirred:Mechanical Stress Testing of an IgGlAntibodyj J. Pharm. Sci. , 97, 4347-4366 (2008)) 〇 研究者已 在非變性條件下成功分離出非原生的、錯誤折疊的蛋白質，所述分離使用利用離子 交換的水性色譜分析法（"IEC"）（參見，例如，Gagnon，P. J.，Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol，Immunol. Methods，336, 222-228 (2008) ;Gagnon，P.，Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems，Tucson，AZ，57-87(1996) ；Shukla,A. A. , and Yigzaw, Y. , Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry,Shukla,A.,Etzel,M., and Gadam，S.，eds.，179-227, CRC Press, Boca Raton (2007) ；Staby, A. , Jacobsen, J. H. , Hansen, R. G. , Bruus, U. K. , Jensen, I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins,J.Chromatogr. A, 1118, 168-179(2006) ；ShukIa,A. A. , Hub bard,B. ,Tressel,T. ,Guhan, S. , Low, D. J. , Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches，Chromatogr. B，848,28-39 (2007)； Shihara,T.,Kadoya, T. J. , Accelerated Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic:Design and Case Study of Chromatography Processes，Chromatogr.A，1176，149-156 (2007) ；Fahrner,R. L. , Knudsen, H. L. , Basey, C. D. , Galan, W. , Feuerhelm, D. , Vanderlaan, M. , Blank, G. S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies:Development,Ope ration,and Validation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev.，18, 301-27 (2001);和 Yigzaw，Y.，Hinckley，P.，Hewig，A. and Vedantham，G.，Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech.，10, 421-426 (2009))、利用疏水相互作用的水性色譜分析法（"HIC"）（參見， 例 如，Chen，J.，Tetrault，J.，Ley，A.，Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process,J.Chromatogr.A., 1177,272-81 (2008) ;Gagnon，P.，and Grund，E.，Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 4:Controlling Selectivity,BioPharmj 9, 54-64(1996)； 和 Lu,Y. , Williamson, B. , and Gillespie, R. , Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process，Curr. Pharm. Biotech.，10, 427-33(2009))和羥基磷灰石（"HA"） 色譜分析法（參見，例如Aoyama，K.，Chiba，J.，Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads,J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993)； Luellau,E. ,Marison, W. , von Stockar，IL，Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Techn ology, Carondo, M. , ed. ,Kluwer Academic Publishers, Netherlands,265-269 (1997)； Luellau,E., von Stockar, U. , Vogt, S. , Freitag, R. , Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A.，796，165-175 (1998) ;Yamakawa，Y.，Chiba，J.，High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Liquid. Chromatogr. , 11, 665-681 (1998) ；Coppola, G. , Underwood, J. , Cartwrigh t, G. , Hearn, M. T. , High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids，Peptides and Proteins:XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies,J. Chromatogr. A. , 476, 269-290(1989)； Josics, D. , Loster, K. , Kuhlj R. , Noll, F. , Reusch, J. , Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLCj Biol.Chem. Hoppe-Seylars，372，149-156 (1991) ;Gagnon，P.，and Beam,K. , Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography，Curr. Pharm. Biotech. (2008))〇 [0008] 現有教導例如上述引用的這些還未證實對于從不正確折疊的依那西普中分離正 確折疊的依那西普的應用是有用的，因為它們不能提供定性和/或定量充足的樣品。相應 地，在本領域中需要有效和高效的分離技術，以與能夠提供非常高純度（即，不正確折疊的 依那西普不存在或以非常低的水平存在）和在商業上有吸引力的產量的依那西普制備物 的、CHO細胞產生的依那西普聯用。
[0009] 本發明采用號稱的"混合模式"色譜分析法。當采用至少兩種不同的力以結合蛋 白質時，用于純化重組表達的蛋白質的色譜分析法可通常被稱為"混合模式"，并可從不需 要的物質中分離所需的蛋白質產物，所述不需要的物質可存在于含所需蛋白質和不需要的 雜質的相對不純的表達產物中。這些力可包括，例如，靜電力和疏水力。
[0010] 混合模式色譜分析法以與更加傳統的色譜分析技術相似的方式運作，因為具有固 定相和流動相。所述固定相通常為不溶性樹脂或凝膠，通常被稱為色譜樹脂，其提供分離的 基礎。所述樹脂包含在允許液體通過并接觸所述樹脂的柱中。與樹脂連接的選擇的化學基 團或結構部分（moiety)的存在使所述色譜樹脂從不需要的物質中分離所需物質的能力成 為可能。這些連接的基團，通常稱為配體，賦予樹脂必要的親和性質（即，由配體中存在的 離子交換結構部分產生的靜電吸引性質，和由配體中存在的疏水結構部分產生的疏水引力 性質），從而使所述樹脂能夠結合不純樣品中的一些蛋白質材料，而不是其它材料，當允許 含所述不純樣品的溶液流經所述色譜柱與所述樹脂接觸時。
[0011] 包含具有這些親和基團的樹脂的色譜柱的固定相塞滿所述色譜柱的內部，所述色 譜柱通常是一個剛性圓柱體容器，流體可在一端被引入其中，接觸所述樹脂，然后在另一端 離開所述柱。通過將蛋白質產物放入適當的溶液中并允許所述溶液（稱為流動相）經過所 述柱，可將含將被純化的蛋白質的溶液引入（并因此允許其流過）所述柱。當將被純化的 蛋白質產物（稱為分析物）以流動相存在于柱中中時，在所述柱和所述流動相間達到平衡 狀態，意味著蛋白質溶液中的一些物質將依附、結合或粘貼或被親合基團捕捉到所述柱樹 脂上，而所述產物中剩余的物質將不附在所述柱上，而是將流過并流出所述柱，在那兒其可 被收集用于分析、進一步加工，或其可被排放。
[0012] 一旦蛋白質分析物已以上述的方式結合到所述柱上，將使用洗滌步驟（通常稱為 洗脫步驟）以從所述柱上洗脫或釋放所結合的分析物。根據存在于樹脂上以使分析物和所 述柱結合的親和配體的類型（例如，基于電荷的結構部分或疏水部分，或它們的組合，等）， 用于從所述柱上洗脫或釋放分析物的溶液必須對分析物和/或配體具有可克服分析物對 所述樹脂的親和力或吸引力的親和力或吸引力（例如電荷性質、疏水性質、pH特性、鹽濃度 等），從而使所述分析物從所述樹脂（上述提到的固定相）上釋放并進入洗脫介質（流動 相）。一旦被釋放或洗脫至流動相，然后所述分析物可流過并流出所述色譜柱用于最后的收 集、分析等，或轉移到進一步純化的方法或過濾步驟。可理解的是，無論吸引性能或親和性 能引起分析物結合至色譜樹脂上（例如，電荷性能或疏水性能），后續用于洗脫或釋放所述 分析物的流動相溶液都必須具有相互矛盾的一套性質以使所述分析物然后"優選"存在于 所述洗脫介質中而不是保持被捕獲在所述柱樹脂上。
[0013] 與其它單模式色譜分析技術相比，所謂的混合模式色譜分析法獨特之處在于多種 結合和洗脫因素可相互依賴并可彼此相對。例如，當分析物的帶電特性相對于所述柱樹脂 的吸引力具有更強的對于洗脫介質的吸引力（傾向）時，在傳統單一模式的離子交換色譜 分析法中，增加流動相的離子強度可引起樹脂結合的分析物的洗脫或釋放。然而，在混合 模式的色譜分析方法中，其中色譜樹脂使用靜電引力和疏水引力以結合分析物，增加流動 (洗脫）相的離子強度可引起樣品物質從所述柱中釋放，這是基于所述物質的電荷性質，同 時引起或增強分析物中疏水物質的結合，因為這樣的疏水蛋白物質一在基于電荷的洗脫介 質存在下一相對于所述洗脫介質的帶電環境，將傾向于具有更強的吸引力或優選以與所述 柱的疏水配體結合。相應地，雖然鹽濃度的增加可確實引起從固定相置換帶電蛋白物質的 傾向，當流動相中的帶電離子與蛋白質競爭固定相上的結合位點時一然而，可能具有更高 程度的疏水性能的分析物產物混合物的那些部分可具有增強的保持與所述混合模式的色 譜柱的疏水結構部分結合的傾向。在任何給定的蛋白質分離情況下，利用這些現象的能力 幾乎不能被認為是可預測的。
[0014] 混合模式樹脂的兩個實例為Capto? MMC和Capto? Adhere (可購自 GEHealthcare) oCapto? MMC利用附著于固體支撐基質的配體，其可通過陽離子交換（使用 它的羧基基團）、氫鍵結合和疏水作用與分析物相互作用。Capto? MMC的配體示例如下：
[0015]
[0016] Capto? Adhere與Capto? MMC相似之處在于它也米用附著于固體支撐基質的配 體。所述配體，N-芐基-N-甲基乙醇胺，也通過陰離子交換、氫鍵結合和疏水作用與分析物 相互作用。Capto? Adhere配體示例如下：
[0018] 在這兩個配體中，疏水作用預期是弱的。因此，如果這些配體僅具有疏水結構部分 (沒有電荷），那么它們將最可能需要鹽析（蛋白質沉淀）條件用于蛋白質結合。然而，具 有靜電作用可使如此弱的疏水作用足以提供額外的結合力。
【發明內容】
[0019] 本發明的前提是根據如下事實：可使用混合模式色譜分析法，例如使用Capto? MMC和Capto? Adhere作為混合模式色譜樹脂，以純化含正確折疊和不正確折疊蛋白質的 混合物的分析物，包括，例如，含正確折疊和不正確折疊的依那西普的蛋白質混合物，借此 正確折疊的蛋白質可以高效的方式和優異的產量從不正確或錯誤折疊的蛋白質中有效分 離，以得到高度富集所需的、正確折疊的蛋白質的蛋白質制備物。此外，本發明包含實踐本 文描述的混合模式的色譜分離的能力，所述實踐以使從所述色譜分離中得到可不含或基本 不含錯誤折疊產物（如果需要的話）的洗脫產物的方式進行，雖然可以理解，為了平衡產量 和純度的目的，可能發現包括非常低水平的不正確折疊的產物（例如，少于5wt%并優選少 于3wt% )是可接受的以使產量最大化至所需的范圍。
[0020] 相應地，在第一實施方案中，本發明是用于從不正確折疊的蛋白質中分離正確折 疊的蛋白質的混合模式色譜法，其包含以下步驟：(a)將同時含給定蛋白的正確折疊和不 正確折疊構象的第一蛋白混合物與同時具有離子交換結構部分和疏水結構部分的混合模 式色譜樹脂結合；(b)從混合模式樹脂上洗脫正確折疊的蛋白質以得到第二蛋白混合物， 所述第二蛋白混合物包含比所述第一蛋白混合物更高比例的正確折疊蛋白。術語"更高比 例"指在步驟（b)的洗脫液中正確與不正確折疊蛋白的比例至少高于1:1，但最優選高于 約8:2并優選高于約9:1。所述第二蛋白混合物最優選以構成第二蛋白混合物的至少約 95wt %的量包含正確折疊的蛋白。
[0021] 在第二實施方案中，所述方法涉及用于純化蛋白質混合物以從存在于所述混合物 中的不正確折疊的依那西普中分離正確折疊的依那西普的混合模式色譜法，所述方法包括 以下步驟：(a)使具有疏水結構部分和離子交換結構部分的混合模式的色譜樹脂與含包含 正確折疊的依那西普和不正確折疊的依那西普的蛋白質混合物的溶液接觸，以使正確和不 正確折疊的依那西普粘附、結合或捕獲在所述混合模式的色譜樹脂上；和（b)使所述混合 模式的樹脂與能夠從所述混合模式的色譜樹脂上洗脫依那西普蛋白質的溶液接觸以得到 洗脫液，在該洗脫液中，正確折疊的依那西普的量與不正確折疊的依那西普的量的比率較 高，并優選比在步驟（a)中引入所述樹脂的蛋白質混合物中的比率要高很多。
[0022] 第三實施方案中，本發明涉及一種含依那西普的蛋白質混合物，或含所述混合物 的藥學上可接受的制劑，其是根據上述方法的實施方案得到且其中所述蛋白質混合物以構 成大于約90wt%的蛋白質混合物的量包含不正確折疊的依那西普；并以構成少于約5wt% 的蛋白質混合物的量包含不正確折疊的依那西普；且其中所述蛋白質混合物具有構成至少 約95wt. %并優選至少約98wt. %的含依那西普的蛋白質混合物的正確折疊和不正確折疊