人乳頭瘤病毒感染相關癌癥的治療用組合物的制作方法
【專利說明】人乳頭瘤病毒感染相關癌癥的治療用組合物 【技術領域】
[0001] 本申請基于申請號為KR10-2012-0084820、申請日為2012/08/02的韓國專利申請 來要求優先權，其全部內容在此引入本申請作為參考。
[0002] 本發明涉及包括宮頸癌在內的人乳頭瘤病毒感染相關疾病的基因治療用組合物。 【【背景技術】】
[0003] 高危型（High-risk)人乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus :以下稱為 HPV) I6型、人乳頭瘤病毒18型是引起宮頸癌及宮頸非典型增生的主要因素，也是引起生殖器癌和 頭頸部鱗狀細胞癌的原因。宮頸癌是女性惡性腫瘤中最為普通的類型之一。雖然浸潤性宮 頸癌的發病率正在逐漸減少，但作為在發展中國家的所有女性人群中最頻繁發病的癌癥， 占女性癌癥的25%。人乳頭瘤病毒為具有約8000個堿基序列的引起良性、惡性腫瘤的小的 脫氧核糖核酸（DNA)病毒。目前為止，根據基因組的差異，確認了 100多個以上的人乳頭瘤 病毒亞型，并完全分析了約90個左右的人乳頭瘤病毒的基因型。在這種類型中，幾乎90% 的宮頸癌與高危型人乳頭瘤病毒（例如，人乳頭瘤病毒16型、人乳頭瘤病毒18型、人乳頭 瘤病毒31型、人乳頭瘤病毒33型、人乳頭瘤病毒35型、人乳頭瘤病毒45型、人乳頭瘤病毒 51型、人乳頭瘤病毒52型、人乳頭瘤病毒56型）有關。50%以上的感染了人乳頭瘤病毒 的宮頸癌與人乳頭瘤病毒16型有關，之后與人乳頭瘤病毒18型（12% )、人乳頭瘤病毒45 型（8% )、人乳頭瘤病毒31型（5% )有關。這種人乳頭瘤病毒將2個致癌（oncogenic) 蛋白E6和E7編碼化。這些蛋白質均與由人乳頭瘤病毒介導的細胞無限增殖化及細胞轉化 有關。致癌性E6蛋白與野生型的p53腫瘤抑制蛋白相結合來通過泛素途徑分解p53。另 一方面，E7蛋白直接與Rb相結合來進行過度磷酸化。首先，E6與作為E3泛素蛋白連接酶 (ubi quit in-protein ligase)的 E6 相關蛋白（E6-AP，E6_associated protein)形成復合 體。之后，E6/E6-AP復合體與野生型的p53相結合來進行泛素化，從而妨礙由對DNA損傷 的P53介導的細胞的反應。雖然主要借助由Mdm2介導的泛素化來調節p53腫瘤抑制蛋白， 但在感染人乳頭瘤病毒的宮頸癌細胞中，p53的分解在Mdm2中完全被由E6介導的泛素化 所代替。因此，與其他很多癌癥不同，感染人乳頭瘤病毒的宮頸癌幾乎具有野生型的P53基 因。但是，一貫被E6蛋白分解，因而p53蛋白的表達水平非常低。尤其，人乳頭瘤病毒E6 蛋白為只能夠殺死宮頸癌細胞的特定靶，因而相當受矚目。將E6或E6/E6-AP復合體作為 靶的這種戰略包括多種治療方法。
[0004] 有細胞毒素藥物的使用、放出病毒的E6致癌蛋白的鋅的抑制劑、模擬E6-AP的模 擬表位（mimotope)、抗E6核酶、將病毒的E6致癌蛋白作為靶的肽適體、將病毒的E6致癌基 因作為靶的小干擾核糖核酸（RNA)以及它們的并用處理等。最近，證明了小干擾核糖核酸 不僅可在動物細胞中選擇性地使內部基因沉默，還可在由病毒引起的疾病中選擇性地使病 毒的基因沉默。由小干擾核糖核酸的轉染引起的核糖核酸干擾（RNAi)成為了用于治療人 類的病毒感染的新的治療方法。在感染人乳頭瘤病毒的宮頸癌細胞中，將E6和E7的基因 作為祀的小干擾核糖核酸引起p53和pRb的積累，導致細胞凋亡（apoptosis)或細胞衰老。 證實了在感染人乳頭瘤病毒16型的宮頸癌細胞株和感染人乳頭瘤病毒18型的宮頸癌細胞 株的情況下，將病毒的E6及E7癌基因作為靶的核糖核酸干擾選擇性地使這些蛋白的表達 沉默。
[0005] 另一方面，具有對多種核酸的變形（例如，堿基、糖和/或磷酸鹽）的核酸的、 基于血清核糖核酸酶的分解被抑制，因而可增加功效。在本領域中，眾所周知的有記 述可作為核酸導入的糖、堿基及磷酸鹽變形的幾種例。例如，使寡核苷酸以借助基于 核酸酶耐藥組的變形，如2' -氨基、2' -C-烯丙基、2' -氟基、2' -0-甲基、2' -H核苷 酸堿基變形來增大穩定性和/或生物學活性的方式變形（參照Eckstein et al.，PCT 公開公報 WO 92/07065 ;文獻[Perrault et al. ,Nature 344:565-568, 1990];文獻 [Pieken et al. , Science 253:314-317,1991];文獻[Usman and Cedergren, Trends in Biochem.Sci. 17:334-339, 1992] ;Usman et al. PCT 公開公報 TO 93/15187 ;Sproat, 美國專利第 5334711 號及文獻[Beigelman et al. , J. Biol. Chem. , 270:25702, 1995]; Beigelman et al·, PCT 公開公報WO 97/26270 ;Beigelman et al·,美國專利第 5716824 號；Usman et al.,美國專利第 5627053 號；Woolf et al. ,PCT 公開公報 WO 98/13526 Jhompson et al.,美國專利申請第 60/082404 號（1998 年 4 月 20 日申 請）；文獻[Karpeisky et al·, Tetrahedron Lett·,39: ΙΟΙ, I"8];文獻[Earnshaw and Gait, Biopolymers(Nucleic acid Sciences)48:39-55, 1998];文獻[Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67:99-134, 1998];以及文獻[Burlina et al.,Bioorg. Med. Chem. 5:1999-2010, 1997])。可將類似的變形用于使本發明的核酸變形。
[0006] 1999年，并用處理了基于順鉑（Cisplatin)的化療和放射治療，其結果，明顯改善 了局部患有重度宮頸癌的女性的生存率。當前，順鉑為廣泛用于治療包括卵巢癌、子宮頸 癌、頭頸癌、非小細胞肺癌等的癌癥的DNA損傷藥物。最近，調查出基于鉬（Platinum)的藥 劑的作用機制。但是，尚未完全理解包括在細胞上基于順鉑治療的藥物的吸收及排出的調 節、DNA損傷的信號化、細胞周期的追蹤、DNA修復及細胞死亡的過程。在人乳頭瘤病毒18 型海拉（HeLa)細胞中，在順鉑治療后，p53蛋白從由E6介導的分解中脫離，并優先積累于核 仁。并且，在人乳頭瘤病毒16型SiHa細胞中，借助同時放射療法和順鉑治療來恢復了 p53 功能，從而增加了放射線感受性。
[0007] 因此，本發明人努力探索能夠使對E6/E7特異性的小干擾核糖核酸發生化學變形 來表現單獨或復合組合的抗癌效果，或者當與現有的化學療法或放射療法并用執行時，能 夠表現協同效應的有效的新序列的小干擾核糖核酸，其結果，確認了在以下實施例及發明 要求保護范圍中所羅列的核苷酸及它們的特定組合減少作為相關蛋白的TP53及E7的表達 和人乳頭瘤病毒E6信使核糖核酸（mRNA)，并誘導細胞的死亡，通過實驗證明了在單獨或與 抗癌劑并用給藥方面，功效更優于堿基序列殘基無變形的核糖核酸。
[0008] 本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。所引用的論文及 專利文獻的公開內容全部插入于本說明書作為參照，從而更加明確說明本發明所屬的技術 領域的水平及本發明的內容。 【
【發明內容】
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[0009] 【發明要解決的技術課題】
[0010] 本發明人為了開發對由人乳頭瘤病毒感染引起的多種疾病的有效的基因治療劑 而銳意研宄努力。其結果發現了在利用將人乳頭瘤病毒16型或人乳頭瘤病毒18型病毒的 E6/E7基因作為靶的表達抑制用特定核糖核酸或它們的堿基變形的核糖核酸序列的情況 下，可有效抑制人乳頭瘤病毒的基因表達，對包括宮頸癌在內的人乳頭瘤病毒感染相關疾 病表現出優秀的治療活性，從而完成了本發明。
[0011] 因此，本發明的目的在于，提供人乳頭瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染 相關疾病，具體地人乳頭瘤病毒感染相關癌癥，更具體地宮頸癌（cervical cancer)的預防 或治療用組合物。
[0012] 本發明的另一目的在于，提供人乳頭瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染 相關疾病，具體地人乳頭瘤病毒感染相關癌癥，更具體地宮頸癌（cervical cancer)的預防 或治療方法。
[0013] 以下發明的詳細說明、發明要求保護范圍及附圖，將更加明確本發明的其他目的 及優點。
[0014] 【解決課題的技術方案】
[0015] 根據本發明的一實施方式，本發明提供人乳頭瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相關疾病的預防或治療用組合物，上述人乳頭瘤病毒感染相關疾病的預防或治 療用組合物包含選自由序列表中序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列66、序列 72、序列84、序列90、序列108及它們的反義核苷酸序列組成的組中的一種以上的核苷酸序 列作為有效成分。
[0016] 本發明人為了開發對由人乳頭瘤病毒感染引起的多種疾病的有效的基因治療劑 而銳意研宄努力。其結果發現了在利用將人乳頭瘤病毒16型或人乳頭瘤病毒18型病毒的 E6/E7基因作為靶的表達抑制用特定核糖核酸或它們的堿基變形的核糖核酸序列的情況 下，可有效抑制人乳頭瘤病毒的基因表達，對包括宮頸癌在內的人乳頭瘤病毒感染相關疾 病表現出優秀的治療活性。
[0017] 根據本發明，序列表中序列16、序列22、序列28、序列34及序列40將人乳頭瘤病 毒16型病毒作為靶，序列表中序列72、序列84、序列90及序列108為將人乳頭瘤病毒16 型病毒作為靶的表達抑制用核糖核酸序列。
[0018] 在本說明書中，術語"核苷酸"意味著以單鏈或雙鏈形態存在的核 糖核苷酸，只要不以其他特殊的方式提及，那么就包含天然核苷酸的類似物 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) ;Uhlman 及 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990))〇
[0019] 在本說明書中，術語"表達抑制"意味著引起靶基因的功能下降，優選地，意味著由 此靶基因的表達無法被檢測到或以無意義的水平存在。
[0020] 根據本發明的優選實例，本發明的核苷酸序列為具有對人乳頭瘤病毒18型病毒 或人乳頭瘤病毒16型病毒的E6/E7基因的基因沉默（silencing)能力的核糖核酸序列，更 優選為小干擾核糖核酸、短發夾核糖核酸、微小核糖核酸（miRNA)或反義寡核苷酸。
[0021] 在本說明書中，術語"小干擾核糖核酸"意味著可通過特定信使核糖核酸的裂解 (cleavage)誘導核糖核酸干擾（RNAi，RNA interference)現象的短的雙鏈核糖核酸。小 干擾核糖核酸由具有與靶基因的信使核糖核酸同源的序列的正義核糖核酸和具有與其互 補的序列的反義核糖核酸鏈構成。小干擾核糖核酸可抑制靶基因的表達，因而提供為有效 的基因敲減方法或基因治療（gene therapy)方法。
[0022] 小干擾核糖核酸并不局限于核糖核酸之間成對的雙鏈核糖核酸部分完全成對，而 是可包括借助錯配（對應的堿基不互補）、凸起（沒有與一側鏈相對應的堿基）等不成對的 部分。總長為10至100個堿基，優選為15至80個堿基，最優選為17至23個堿基。只要 可借助核糖核酸干擾效果來抑制革G基因的表達，鈍性（blunt)末端或粘性（cohesive)末端 均可成為小干擾核糖核酸末端結構。粘性末端結構均可為3末端突出的結構和5末端側突 出的結構。突出的堿基數并不受限制。例如，堿基數可以為1至8個堿基，優選為2至6個 堿基。并且，小干擾核糖核酸在可維持靶基因的表達抑制效果的范圍內，例如可在一側末端 的突出部分包含低分子核糖核酸（例如，轉運核糖核酸（tRNA)、核糖體核糖核酸（rRNA)、病 毒核糖核酸等的天然核糖核酸分子或人工核糖核酸分子）。小干擾核糖核酸末端結構無需 兩側均具有裂解結構，也可以為雙鏈核糖核酸的一側的末端部位借助連接核糖核酸相連接 的莖環型結構。作為連接核糖核酸的長度，只要不妨礙莖部分成對，就不受特殊限制。
[0023] 在本說明書中，術語"