細胞組裝小腸黏膜下層仿生復合工程骨及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學工程中利用組織工程技術構建人造組織/器官技術領域，具體是一種細胞組裝小腸黏膜下層仿生復合工程骨及其制備方法。
【背景技術】
[0002]我國每年約有350萬人因不同原因出現骨缺損，骨手術移植約為150萬例，對替代骨的需求量非常大，尤其是大骨骼損傷的替代骨。隨著組織工程技術的快速發展，在體外構建具有成骨傳導性和成骨誘導性的人造替代骨是解決這一需求的重要途徑。骨架材料在組織工程骨構建中起著至關重要的作用，相比于其他合成材料，天然細胞外基質(ECM)材料由于其以下特點:1.優異的生物相容性；2.最接近于體內細胞生長微環境的三維結構；3.為細胞生命活動提供了各種活性分子，一直被認為是理想的組織工程材料。豬小腸黏膜下層(SIS)是目前研宄最多的天然細胞外基質材料，已通過美國FDA批準，被廣泛用來構建人造膀胱、人造尿道、人造食道、人造血管和人造皮膚等軟組織。SIS材料骨架成分膠原蛋白(collagen)已經被廣泛用來作為骨架材料和藥物載體用于骨組織工程。SIS相比于膠原有兩大優點:1.SIS是個天然的藥物庫，它保留了許多有利于骨再生的生物活性分子；2.SIS在取材上更加便利，成本也要遠低于膠原。國內外用SIS材料作為骨組織工程骨架材料報道已有一些，但是主要有兩個問題使之無法進一步推廣使用:1.SIS材料機械強度較低，無法在植入體內后提供足夠機械支撐；2.成骨誘導性的不足。如果能解決上述兩個難題，SIS材料將成為理想的骨組織工程材料。由于SIS本身取自于軟組織，作為骨組織工程骨架材料存在機械強度不足的缺陷，為了使SIS骨架材料在植入體內初期更好地提供支撐，需要增加它的機械強度。
[0003]天然骨的無機成分主要由羥基磷灰石組成，直接將SIS與羥基磷灰石混合作為人造骨，雖然可以提高機械強度，使得基質材料的組成接近于天然骨，但是這種混合只是實現了宏觀組分上模仿天然骨的組成，而在微觀結構上，磷酸鈣分子與其他細胞外基質組分在空間上的分布和結合和天然骨還是有很大差異。
[0004]骨組織工程中所需要的成骨誘導因子一直是一個研宄熱點，BMP-2蛋白雖然是廣泛被認可和采用的最有效成骨誘導因子，但是由于其非常昂貴，而采用BMP基因導入方法又存在一定的安全問題，因此它的臨床使用還是受到成本和安全性的制約；同時BMP-2和其他蛋白藥物都存在穩定性差，在體內半衰期很短的問題，相應對于藥物釋放體系的要求非常高。因此尋找低成本、穩定又可以高效誘導骨再生的小分子化合物來替代BMP是非常有意義的。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是:針對現有技術的不足，提供一種細胞組裝小腸黏膜下層仿生復合工程骨及其制備方法。
[0006]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:細胞組裝小腸黏膜下層仿生復合工程骨，該仿生復合工程骨的微觀結構包括SIS膠原纖維骨架、礦物化結晶和細胞外基質成分，所述的SIS膠原纖維骨架呈網狀纖維結構，所述的礦物化結晶和所述的細胞外基質成分沉積于所述的SIS膠原纖維骨架上，所述的礦物化結晶和所述的細胞外基質成分由MC3T3-E1 Subclone 14細胞指導和分泌得到，所述的礦物化結晶主要由輕基磷灰石結晶構成。
[0007]本發明細胞組裝小腸黏膜下層仿生復合工程骨具有較高的機械強度，該組織工程骨與天然骨內部的礦物化結構和分布極為接近，具有高度類似于天然骨的微觀結構。
[0008]所述的礦物化結晶的沉積量為68.50±6.75 mg/cm3，可確保仿生復合工程骨的機械強度滿足使用要求。
[0009]上述細胞組裝小腸黏膜下層仿生復合工程骨的制備方法，包括以下步驟:
O細胞培養及傳代:準備含有5-10%胎牛血清的a -MEM培養基作為培養液；將從小鼠顱頂前骨MC3T3-E1細胞系中分離的MC3T3-E1 Subclone 14細胞置于5% 二氧化碳濃度、370C的細胞培養箱中培養，所述的培養液的用量為200 μ L/cm2，每隔48h棄去舊的培養液并加入等量新的培養液，確保培養液的用量為200 μ L/cm2,當培養至MC3T3-E1 Subclone 14細胞匯合度大于90%時進行細胞傳代，所述的細胞傳代的過程為:棄去舊的培養液，加入用量為200 μ L/cm2的PBS緩沖液，清洗2_3次；然后加入用量為40-50 μ L/cm 2的0.25%的胰酶，在37°C下孵育I min ;收集細胞并加入至離心管，在1000 rpm轉速下離心2 min ;棄去上清，然后加入I mL培養液重懸細胞，得到細胞懸液，對此細胞懸液進行細胞計數并計算該細胞懸液的細胞密度；根據計算得到的細胞密度，將所述的細胞懸液以(1-2) X 14細胞/cm2的用量加入至新的細胞培養瓶，然后在該細胞培養瓶中加入5 mL的培養液混勻，置于細胞培養箱中培養；重復上述細胞傳代過程直至獲得足夠量的MC3T3-E1 Subclone 14細胞；
2)SIS仿生工程骨的制備:取出干燥無菌的SIS材料，用剪刀或合適器械裁剪成所需的大小及形狀，再將裁剪好的SIS材料浸泡于所述的培養液，置于37°C的細胞培養箱中預處理24-48h ;取匯合度為70-80%的MC3T3-E1 Subclone 14細胞，加入至離心管，在1000 rpm轉速下離心2 min,棄去上清，再加入I mL培養液重懸細胞，得到細胞懸液，對此細胞懸液進行細胞計數并計算該細胞懸液的細胞密度，然后根據計算得到的細胞密度將該細胞懸液稀釋至I X 16細胞/mL的終濃度，即配制得到細胞懸液；取出浸泡24-48h的SIS材料，平鋪于新的細胞培養皿上，再按5 X 13細胞/mm2的細胞密度將配制得到的稀釋的細胞懸液均勻滴加于SIS材料上，完成對SIS材料的細胞種植，然后立即放入細胞培養箱中孵育；孵育4-6h后，取出植有細胞的SIS材料，用l-2mL/cm2用量的培養液清洗2_3次，除去表面未黏附的細胞，之后以2.5 mL/cm2的用量加入新的培養液，最后將該植有細胞的SIS材料置于細胞培養箱孵育；
3)復合工程骨的制備:植有細胞的SIS材料于細胞培養箱孵育16h后，得到細胞-SIS復合材料，從細胞培養箱中取出該細胞-SIS復合材料，棄去舊的培養液，加入等量誘導礦物化及成骨分化的組合培養液，所述的組合培養液為含有8-15mM的CaCl2、(1-10) X 10_6 M的淫羊藿苷和5-10%胎牛血清的a -MEM培養基，然后置于37°C的細胞培養箱孵育，此后每隔48h更換一次組合培養液，處理4-8周時間后，得到SIS復合工程骨；
4)復合工程骨的去細胞化:取出上述處理得到的SIS復合工程骨，以用量為(1-2)mL/cm2的PBS緩沖液清洗2-3次；此后將該SIS復合工程骨置于_80°C /37°C反復凍融3_5次，每次I h ;之后再次以用量為(l_2)mL/cm2的PBS緩沖液清洗2_3次，進行去細胞化；將去細胞化后的復合工程骨置于_80°C保存備用，此即為細胞組裝小腸黏膜下層仿生復合工程骨。
[0010]本發明方法選用的MC3T3-E1細胞系細胞易保存使用，同時具有體外無限增殖能力，為工程骨制備方法的穩定和產品生產提供了有利條件。
[0011]淫羊藿苷是植物藥淫羊藿的主要活性成分，淫羊藿苷安全、經濟、化學性質穩定，具有促骨再生能力和促血管再生能力，本發明通過淫羊藿苷刺激Sis上的成骨細胞，賦予本發明復合工程骨優異的成骨誘導性。
[0012]本發明方法選用SIS材料作為骨架材料，SIS是以膠原為骨架的細胞外基質材料，含有90