包含肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法

包含肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是2008年6月24日提交的題為"包含肺炎鏈球菌莢膜多糖綴合物的疫苗" 的國家申請號為200880104210. 8 (PCT/EP2008/057997)的發明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及改良的肺炎鏈球菌疫苗。
【背景技術】
[0003] 2歲以下的兒童不能形成對大多數多糖疫苗的免疫應答，因此需要通過與蛋白載 體化學綴合使多糖具有免疫原性。將多糖（T非依賴性抗原）與蛋白（T依賴性抗原）偶聯， 使該多糖具有包括同種型轉換、親和成熟和記憶誘導的T依賴性特性。
[0004] 然而，在重復施用多糖-蛋白綴合物或多糖-蛋白綴合物的組合以形成多價疫苗 時可能存在問題。例如，已報道了使用破傷風類毒素（TT)作為蛋白載體的流感嗜血桿菌b 型多糖（PRP)疫苗在劑量范圍內進行測試，其根據標準嬰兒方案同時以（游離）TT和肺炎 球菌多糖-TT綴合物疫苗進行免疫。隨著肺炎球菌疫苗的劑量上升，對Hib綴合物疫苗的 PRP多糖部分的免疫應答下降，提示多糖的免疫干擾，這可能是由于相同載體蛋白的使用 (Dagan 等人，Infect Tmmun. (1998) ：66:2093-2098) 〇
[0005] 載體蛋白劑量對于針對蛋白本身的體液應答的效應也被證明具有多面性。據報 道，在人類嬰兒體內四價破傷風類毒素綴合物劑量的上升導致對破傷風載體的應答的下降 (Dagan等人，見上文）。對組合疫苗這些效應的經典分析已被描述為載體誘導的表位抑制， 這尚未被完全理解，但被認為是載體蛋白的過量所導致（Fattom, Vaccine 11:126(1999))。 這表現為導致針對載體蛋白的B-細胞和針對多糖的B-細胞對Th-細胞的競爭。如果針對 載體蛋白的B-細胞占優，則沒有足夠的Th-細胞可對特異性針對多糖的B-細胞提供必要 的幫助。然而，觀察到的免疫效應并不一致，在某些情況下載體蛋白的總量提高了免疫應 答，在其它情況下則減少了免疫應答。
[0006] 因此，將多個多糖綴合物組合為單個、有效的疫苗制劑存在著技術難題。
[0007] 肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽性細菌，其造成了相當大的致病率和死亡率（特別是 在青年和老年人中），引起了侵襲性疾病如肺炎、菌血癥和腦膜炎，以及與移生有關的疾病， 如急性中耳炎。據估計在美國60歲以上人群中肺炎球菌肺炎的發病率為每100, 000人中 3至8人。在20%的情況下其導致了菌血癥，以及其它表現如腦膜炎，即使接受抗菌治療， 其死亡率仍然接近30%。
[0008] 肺炎球菌被化學連接的多糖包封，該多糖帶來了血清型特異性。肺炎球菌具有90 種已知的血清型，而莢膜是肺炎球菌主要的毒性決定因子，因為莢膜不僅針對補體保護該 細菌的內部表面，其本身免疫原性也較差。多糖是T-非依賴性抗原，且不能在MHC分子上 加工或呈現以與T-細胞相互作用。然而，它們可以通過替代性的機制刺激免疫系統，該機 制包括B細胞上表面受體的交聯。
[0009] 在多個實驗中顯示，針對侵襲性肺炎雙球菌疾病的保護很大程度上與特異性針對 該莢膜的抗體相關，所述保護具有血清型特異性。
[0010] 肺炎鏈球菌是嬰兒和幼兒的侵襲性細菌性疾病和中耳炎最常見的誘 因。同樣地，老年人對肺炎球菌疫苗具有較差的應答[Roghmann等人，（1987)，J. Gerontol. 42:265-270]，因此增加了在該人群中細菌性肺炎的發病率[Verghese和 Berk, (1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]〇
[0011] 因此，本發明的一個目標在于開發一種改良的多重血清型肺炎鏈球菌多糖綴合物 疫苗的制劑。
[0012] 附圖簡述
[0013] 圖1在老年恒河猴中的綴合物免疫原性（II期后的抗-PS IgG水平）
[0014] 柱形圖顯示了在老年恒河猴中11價綴合物的免疫原性。淺色條棒表示用在磷酸 鋁佐劑中的11價綴合物兩次接種后的GMC。深色條棒表示用在佐劑C中的11價綴合物兩 次接種后的GMC。
[0015] 圖2在老年恒河猴中的綴合物免疫原性（II期后抗-PS3記憶B細胞頻率）
[0016] 柱形圖顯示了在用佐劑C或磷酸鋁佐劑中的11價綴合物接種后針對PS3的記憶 B細胞。
[0017] 圖3在Balb/c小鼠中PS19F的免疫原性（III期后IgG水平）
[0018] 柱形圖顯示了 4價純多糖和4價dPly綴合物在Balb/C小鼠中的抗多糖19F免疫 原性。
[0019] 圖4在Balb/c小鼠中PS22F的免疫原性（III期后IgG水平）
[0020] 柱形圖顯示了 4價純多糖和4價PhtD綴合物在Balb/C小鼠中的抗多糖22F免疫 原性。
[0021] 圖5血清抗-PS IgG抗體水平
[0022] 柱形圖顯示了在Balb/c小鼠中的抗-22F IgG應答。
[0023] 圖6在Balb/c小鼠中的抗-22F調理-吞噬效價
[0024] 柱形圖顯不了在Balb/c小鼠中的抗-22F調理-吞嗤效價。
[0025] 圖7在幼年C57BI小鼠 III期后以新型佐劑或A1P04免疫誘導的IgG應答的比較
[0026] 柱形圖比較了在幼年C57B1小鼠中以與不同佐劑制成的13價綴合物疫苗免疫后 的IgG應答。所述柱與右側欄所示的順序相同。
[0027] 圖8 PhtD和dPly蛋白組合在恒河猴中針對19F型肺部移生的保護效力
[0028] 柱形圖顯示不同疫苗組合在猴肺炎模型中的保護效力。"死亡"組包括將死亡但施 用了抗生素處理的猴。
[0029] 圖9血清抗-PhtD IgG應答
[0030] 柱形圖顯示在Balb/c小鼠中以22F-PhtD或22F-AH-PhtD綴合物免疫后的抗PhtD IgG應答。
[0031] 圖10在小鼠中針對4型肺炎球菌攻擊的保護
[0032] 在小鼠中以22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后針對4型肺炎球菌攻擊的保護。
[0033] 圖11在以PhtD免疫和以針對血清型3多糖的抗體被動免疫后針對肺炎鏈球菌菌 株3/43的致命攻擊的保護。
[0034] 圖12在以PhtD免疫和以針對血清型1多糖的抗體被動免疫后針對肺炎鏈球菌菌 株1/57的致命攻擊的保護。
[0035] 圖13在以多價綴合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中針對血清型19A的調理吞 噬效價。
[0036] 圖14在以多價綴合物疫苗免疫的老年C57黑色小鼠中針對血清型22F的調理吞 噬效價。
[0037] 圖15在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型19A的調理吞噬效 價。
[0038] 柱 2-llV+19A-dPly gmbs+22F-PhtD 0· 1 μg/50μ 1 ;柱 4-llV+19A-dPly gmbs+22F-PhtD-E 0·1 μ g/50 μ I ;柱 62-11V+19A-DT+22F-PD0. 1 μ g/50 μ I
[0039] 圖16在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型22F的調理吞噬效 價。
[0040] 圖17在以多價綴合物疫苗免疫的豚鼠中針對血清型19A的調理吞噬效價。
[0041] 圖18在以多價綴合物疫苗免疫的豚鼠中針對血清型22F的調理吞噬效價。
[0042] 圖19在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型19A的調理吞噬效 價。
[0043] 圖20在以多價綴合物疫苗免疫的Balb/c小鼠中針對血清型22F的調理吞噬效 價。
[0044] 圖21在以多價綴合物疫苗免疫的OFl小鼠中針對血清型19A的調理吞噬效價。
[0045] 圖22在以多價綴合物疫苗免疫的OFl小鼠中針對血清型22F的調理吞噬效價。
[0046] 發明詳述
[0047] 本發明提供了包含來自血清型19A和19F的肺炎鏈球菌莢膜糖綴合物的免疫原性 組合物，其中19A與作為第一細菌類毒素的載體蛋白綴合，19F與作為第二細菌類毒素的載 體蛋白綴合，且該肺炎鏈球菌莢膜糖中的2-8種與蛋白D綴合。
[0048] 術語莢膜糖包括莢膜多糖和由莢膜多糖衍生的寡糖。寡糖包含至少4個糖殘基。 術語綴合物和綴合的涉及與載體蛋白共價結合的莢膜糖。
[0049] 針對本發明的目的，"免疫人類宿主抗COPD的惡化"或"治療或預防COPD的惡化" 或"減少COro的惡化的嚴重性"指降低COPD的惡化的發生率或比例（例如減少0. 1、0. 5、 1、2、5、10、20%或更多的比例），例如在以本發明的組合物或疫苗免疫的患者組中。
[0050] 術語細菌類毒素包括通過遺傳突變、通過化學處理或通過綴合失活的細菌毒素。 合適的細菌類毒素包括破傷風類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素、細菌溶細胞素或肺炎 球菌溶血素。肺炎球菌溶血素（Ply)的突變已被描述減弱了肺炎球菌溶血素的毒性（W0 90/06951，W0 99/03884)。類似地，已知降低毒性的白喉毒素遺傳突變（參見下文）。白喉 毒素的遺傳解毒類似物包括CRM197和在US 4, 709, 017、US 5, 843, 711、US 5, 601，827和 US 5, 917, 017中描述的其它突變體。CRM197是白喉毒素的非毒性形式，但與白喉毒素在 免疫學上無法區分。CRM197可由通過產毒素的棒狀桿菌噬菌體b的亞硝基胍突變生成的 無產毒相β197?οχ感染的白喉桿菌生成（Uchida等人.Nature New Biology (1971) 233; 8-11) ARM197蛋白與白喉毒素具有相同的分子量，但因在結構基因中具有單個堿基變化而 與之不同。這導致在52號位上由甘氨酸轉變為谷氨酰胺的變化，使得片段A不能結合NAD， 從而不具毒性（Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46 ;69_94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983p560_564)〇
[0051] 第一和第二細菌類毒素可相同或不同。當第一和第二細菌類毒素不同時，意味 著它們具有不同的氨基酸序列。所述第一細菌類毒素選自破傷風類毒素、白喉類毒素、 CRM197、百日咳類毒素、細菌溶細胞素以及肺炎球菌溶血素。所述第二細菌類毒素選自破傷 風類毒素、白喉類毒素、CRM197、百日咳類毒素、細菌溶細胞素和肺炎球菌溶血素。
[0052] 例如，19A和19F可被分別綴合至破傷風類毒素和破傷風類毒素；白喉類毒素和 白喉類毒素；Crml97和CRM197、肺炎球菌溶血素和肺炎球菌溶血素、破傷風類毒素和白喉 類毒素；破傷風類毒素和CRM197 ;破傷風類毒素和肺炎球菌溶血素；白喉類毒素和破傷風 類毒素；白喉類毒素和CRM197、白喉類毒素和肺炎球菌溶血素；CRM197和破傷風類毒素、 CRM197和白喉類毒素；CRM197和肺炎球菌溶血素；肺炎球菌溶血素和破傷風類毒素；肺炎 球菌溶血素和白喉類毒素；或肺炎球菌溶血素和CRM197。
[0053] 本發明的免疫原性組合物包含 2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4 或 2、3、 4、5、6、7或8種莢膜糖綴合物，其中蛋白D為載體蛋白。例如，來自血清型1、3、4、5、6A、6B、 7卩、叭、14、18(：、19六、19?、22?或23?的糖被綴合至蛋白0。例如，選自血清型1、3、4、5、6八、 68、7卩、聽、14、18(：、19六、19卩、22卩和23?的2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、 4、5、6、7或8種糖被綴合至蛋白D。
[0054] 在一個實施方式中，來自至少血清型1和3、1和4、1和5、1和6A、1和6B、1和7、 1 和 9V、1 和 14、1 和 22F、1 和 23F、3 和 4、3 和 5、3 和 6A、3 和 6B、3 和 7F、3 和 9V、3 和 14、3 和 22F、3 和 23F、4 和 5、4 和 6A、4 和 6B、4 和 7F、4 和 9V、4 和 14、4 和 22F、4 和 23F、5 和 6A、 5 和 6B、5 和 7F、5 和 9V、5 和 14、5 和 22F、5 和 23F、6A 和 6B、6A 和 7F、6A 和 9V、6A 和 14、6A 和 22F、6A 和 23F、6B 和 7F、6B 和 9V、6B 和 14、6B 和 22F、6B 和 23F、7F 和 9V、7F 和 14、7F 和 22F、7F 和 23F、9V 和 14、9V 和 22F、9V 和 23F、14 和 22F、14 和 23F 或者 22F 和 23F 的糖被綴 合至蛋白D。
[0055] 在一個實施方式中，來自至少血清型1、3和4 ;1、3和5 ;1、3和6A ;1、3和6B ;1、3 和 7F ;1、3 和 9V ;1、3 和 14 ;3、4 和 7F ;3、4 和 5 ;3、4 和 7F ;3、4 和 9V ;3、4 和 14 ;4、5 和 7F ; 4、5 和 9V ;4、5 和 14 ;5、7F 和 9V ;5、7F 和 14 ;7F、9V 和 14 ;1、3、4 和 5 ;3、4、5 和 7F ;4、5、7F 和 9V ;4、5、7F 和 14 ;4、5、9V 和 14 ;4、7F、9V 和 14 ;5、7F、9V 和 14 ;或者 4、5、7F、9V 和 14 的 糖被綴合至蛋白D。
[0056] 在一個實施方式中，在本發明的免疫原性組合物中存在的莢膜糖綴合物中的一半 或少于一半或少數包含作為載體蛋白的蛋白D。例如，在10價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同 血清型的莢膜糖中的2、3、4或5種與蛋白D綴合。例如，在11價肺炎鏈球菌疫苗中，來自 不同血清型的莢膜糖中的2、3、4或5種與蛋白D綴合。例如，在12價肺炎鏈球菌疫苗中， 來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5或6種與蛋白D綴合。例如，在13價肺炎鏈球菌疫 苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5或6種與蛋白D綴合。例如，在14價肺炎鏈 球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6或7種與蛋白D綴合。例如，在15 價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6或7種與蛋白D綴合。例 如，在16價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7或8種與蛋白 D綴合。例如，在17價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、5、6、7或8 種與蛋白D綴合。例如，在18價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖中的2、3、4、 5、6、7、8或9種與蛋白D綴合。例如，在19價肺炎鏈球菌疫苗中，來自不同血清型的莢膜糖 中的2、3、4、5、6、7、8或9種與蛋白D綴合。可選地，與蛋白D綴合的血清型選自上述的組。
[0057] 在一個實施方式中，除了 19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物 進一步包含肺炎鏈球菌莢膜糖4、6B、9V、14、18C和23F的綴合物。
[0058] 在一個實施方式中，除了 19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物 進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、68、7?、聽、14、18(：和23?的綴合物。
[0059] 在一個實施方式中，除了 19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物 進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、4、5、68、7?、聽、14、18(：、22?和23?的綴合物。
[0060] 在一個實施方式中，除了 19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物 進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。
[0061] 在一個實施方式中，除了 19A和19F的肺炎鏈球菌糖綴合物外，該免疫原性組合物 進一步包括肺炎鏈球菌莢膜糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、22F和23F的綴合物。
[0062] 本發明的肺炎鏈球菌疫苗通常將包含莢膜糖抗原（可選地綴合），其中所述糖來 自至少十種肺炎鏈球菌血清型。肺炎鏈球菌莢膜糖的數量范圍可從10種不同血清型（或 "V"，價）至23種不同血清型（23v)。在一個實施方式中，具有10、11、12、13、14或15種不 同血清型。在本發明另一實施方式中，該疫苗可包含綴合的肺炎鏈球菌糖和未綴合的肺炎 鏈球菌糖。任選地，糖血清型的總數少于或等于23。例如，本發明可包含10種綴合血清型 和13種未綴合糖。該疫苗可以類似的方式包含11、12、13、14或16種綴合糖和分別12、11、 10、9或7種未綴合糖。
[0063] 在一個實施方式中，本發明的多價肺炎球菌疫苗將選自如下血清型：1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F，盡管可以 理解，根據接受該疫苗的接受者的年齡以及該疫苗將施用的地理位置，一種或兩種其它血 清型可被取代。例如，10價疫苗可包含來自血清型1、4、5、68、7?、聽、14、18(：、19?和23?的 多糖。11價疫苗還可包含來自血清型3或19A的糖。12或13價兒童（嬰兒）疫苗還可包 括添加了血清型6A和19A，或者6A和22F，或者19A和22F，或者6A和15,或者19A和15， 或者22F和15的11價制劑（包含來自血清型3的糖），而13價老年疫苗可包括添加了血 清型19A和22F、8和12F，或者8和15,或者8和19A，或者8和22F，或者12F和15,或者 12F和19A，或者12F和22F，或者15和19A，或者15和22F的10或11價制劑。14價兒童 疫苗可包括添加了血清型3、6A、19A和22F ;血清型6A、8、19A和22F ;血清型6A、12F、19A和 22F ;血清型6A、15、19A和22F ;血清型3、8、19A和22F ;血清型3、12F、19A和22F ;血清型 3、15、194和22?;血清型3、64、8和22?;血清型3、64、12?和22? ;或者血清型3、6八、15和 22F的上述10價制劑。
[0064] 在一個實施方式中該組合物包含來自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F* 23F(任選地綴合）的莢膜糖。在本發明進一步的實施方式中包括至少11種糖抗原（任選 地綴合），例如，來自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖。在本發明進 一步的實施方式中包括至少12或13種糖抗原，例如，疫苗可包含來自血清型1、3、4、5、6A、 68、7卩、聽、14、18(：、19六、19卩和23?的莢膜糖或者來自血清型1、3、4、5、68、7卩、叭、14、18(：、 19A、19F、22F和23F的莢膜糖，盡管本發明還可預期其它的糖抗原，例如23價（例如血清型 1、2、3、4、5、68、7卩、8、9隊9￥、10八、11八、12卩、14、15、17卩、18(：、19八、19卩、20、22卩、23卩和33卩）。
[0065] 本發明的免疫原性組合物包含來自流感嗜血桿菌的蛋白D(PD)(參見EP0594610 圖9)。流感嗜血桿菌是中耳炎的關鍵引發微生物，本發明人已顯示在肺炎鏈球菌疫苗中 包含該蛋白將提供針對與中耳炎相關的流感嗜血桿菌的保護水平（Pyrmula等人Lancet 367;740-748(2006))。一方面，Η)作為一種或多種糖的載體蛋白存在。在另一方面，蛋白 D可作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。在進一步方面，蛋白D同時作為載體蛋白和作為游 離蛋白存在。蛋白D可以全長蛋白或片段使用（W00056360)。在其它方面，蛋白D作為多數 糖的載體蛋白存在，例如糖中的6、7、8、9或更多種可與蛋白D綴合。在該方面，蛋白D還可 作為游離蛋白存在