一種上調Runx2轉錄活性的化合物在防治骨質疏松中的應用
【技術領域】
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[0001]本發明屬于醫藥領域，涉及一種化合物在防治骨質疏松中的應用。具體來說，本發明涉及所述化合物在制備Runx2表達活性上調劑、細胞內堿性磷酸酶活性上調劑以及抑制多核成熟破骨細胞形成藥物中的應用。
【背景技術】
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[0002]骨質疏松是一種以骨量減少，骨微結構破壞，導致骨脆性增加，容易發生骨折為特征的全身代謝性骨病。骨質疏松可發生于任何人群和任何年齡，多見于中老年人。骨代謝平衡是由成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收兩個動態過程精妙地調控的。當骨吸收超過骨形成時，會出現骨量減少，可出現骨丟失，發生骨質疏松。
[0003]治療骨質疏松的藥物通常分為兩類:抗骨吸收藥物和促進骨形成藥物。抗骨吸收藥物通過抑制破骨細胞的活性從而減少骨吸收。目前可用的抗骨吸收藥物有雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調節劑、降鈣素和雌激素等。對于已經患有骨質疏松癥或骨量嚴重丟失的人群，單純抑制骨吸收顯然不夠，促進成骨形成已成為治療骨質疏松的新型重要策略，此類藥物還能夠直接促進骨折并發癥后的骨再生。目前人源重組甲狀旁腺激素(rhPTH)，是美國FDA唯一批準上市的促進骨形成藥物。其具體作用機制仍在研宄中，可能是影響多條信號通路，改變成骨細胞、骨系細胞、破骨細胞和骨細胞的活性[JilkaRL.Bone, 2007, 40 (6): 1434-1446.]。rhPTH作為當前最為有效的促進骨形成藥物，也存在著一定的局限性。因此，開發新型多效的小分子促進骨形成藥物，有望在未來的骨質疏松治療領域具有廣闊前景。
[0004]成骨細胞作為主要的骨形成細胞，來源于具有成骨分化潛能的間充質干細胞，通過產生堿性磷酸酶(ALP)和骨基質蛋白，包括骨鈣素(OCN)和骨橋蛋白(OPN)，誘導礦化的發生。基于成骨細胞在骨形成中的重要作用，因而認為能增加成骨系細胞增殖或促進成骨分化的化合物具有促進骨形成的效應。
[0005]近幾年，在小鼠和人身上進行的分子遺傳學研宄進展，揭示了參與調控成骨細胞發生的多種轉錄因子及其作用。這些轉錄因子在成骨細胞的定向、分化和功能行使等過程中都發揮了調控作用，使得相關細胞表達特定的表型基因并獲得成骨細胞表型。在這些轉錄因子中，Runx2 (Runt-related transcript1n factor 2)被證實為調節成骨細胞定向和分化的主要轉錄因子。Runx2屬于Runt結構域基因家族成員，在間質細胞發育為骨時開始表達，之后在成骨細胞的整個分化過程中都存在。Runx2能調節多種成骨細胞標記基因，包括Alp、type I collagen、Ocn、Opn的表達及最終礦化的發生。Runx2能調控胚胎時期骨發育和出生后骨形成。Runx2基因敲除的小鼠由于成骨細胞分化受阻，不能通過任何膜內骨化或軟骨內骨化的途徑形成新骨[Ghosh S, Cell, 2002, 109Suppl (0092-8674(Print)):S81-96.]。這也證實Runx2是成骨分化所必需的。在人體中單個Runx2等位基因的失活將引起一種骨形成缺陷性疾病一鎖骨顱發育不全癥[Chen LF, et al EMBOJ, 2002, 21(23):6539-6548.] ο
[0006]此外，多種小分子化合物的促成骨分化效應與Runx2激活有關。白藜蘆醇是一種在紅酒和大量植物中天然存在的植物多酚，能逆轉卵巢去勢大鼠的骨量丟失。體外實驗發現，白藜蘆醇活化的SIRT1-F0X03A復合物能結合至Runx2啟動子遠端的FRE位點，從而上調Runx2的表達，該機制介導了白藜蘆醇誘導人間充質干細胞向成骨方向分化的效應。另夕卜，也有報道指出，小檗堿通過P38MAPK通路活化的Runx2機制誘導成骨細胞分化。在傳統中藥學中，淫羊藿因其強筋骨的功效而常常應用于治療骨質疏松。從該草本中提取出的一種異戊烯基多黃酮醇甙-淫羊藿苷，是其主要的藥理活性物質。研宄發現，淫羊藿苷誘導成骨分化也依賴于Runx2。
[0007]Runx2參與了包括BMP通路、Wnt通路、Notch通路和Hedgehog等通路在內的多條成骨分化和骨形成相關信號通路，并且可能是信號整合的匯集點[Lin GL, et al J Cell Biochem, 2011, 112(12):3491-3501.]。因而推測能有效上調Runx2轉錄活性的化合物，可能囊括了靶向以上各通路的各種活性化合物，其具有潛在的促進成骨分化和骨形成效應。
[0008]綜上所述，基于Runx2在調節成骨分化中的重要作用，本發明構建了 Runx2轉錄活性上調劑細胞篩選模型，并通過篩選，發現化合物N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺具有上調Runx2的轉錄活性，體外活性實驗表明，其具上調細胞內Runx2蛋白水平、上調成骨細胞堿性磷酸酶ALP活性、上調成骨特異性分化基因的表達和增加鈣化結節的產生，同時也發現該化合物可以抑制破骨細胞的形成，是一種潛在抗骨質疏松候選化合物。本發明所述篩選模型以及基于該模型所發現的化合物N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺的抗骨質疏松作用，迄今尚未見有相關報道，系本發明首次發現。所述化合物與臨床上使用的藥物相比，結構沒有相似性，且該化合物具有促進骨形成和抑制骨吸收的雙重抗骨質疏松活性，可能具有新的抗骨質疏松機制，存在廣闊的開發前景。
【發明內容】
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[0009]本發明的目的是提供一種通過細胞篩選模型獲得的N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1, 2-唑-3-甲酰胺化合物在防治骨質疏松中的應用。
[0010]為了達到上述目的，本發明采取以下技術方案:
[0011]1，構建Runx2轉錄活性上調劑細胞篩選模型，并基于該模型發現N_(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺在制備Runx2轉錄活性上調劑中的應用；
[0012]2，N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺在制備Runx2蛋白水平上調劑中的應用；
[0013]3，N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺在制備MC3T3-E1細胞誘導成骨分化的ALP活性上調劑中的應用；
[0014]4，N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑-3-甲酰胺在制備MC3T3-E1細胞誘導成骨特異性分化基因Alp，Ορη, Runx2上調劑中的應用；
[0015]5，N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺在增加C3H10T1/2細胞誘導鈣化結節數目中的應用；
[0016]6，N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺在減少破骨細胞形成中的應用。
[0017]本發明所述Runx2轉錄活性上調劑細胞篩選模型，可以應用于高通量防治骨質疏松疾病化合物篩選，基于該模型篩選出的化合物N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺是一種Runx2轉錄活性上調劑，上調細胞內Runx2的蛋白、細胞內堿性磷酸酶的活性、鈣化結節的數目、成骨分化特異基因mRNA水平以及抑制破骨細胞形成，有望開發成為防治骨質疏松疾病的藥物。
[0018]本發明還提供了以所述化合物為活性成分與藥學上可接受的載體組成的組合物在抗抗骨質疏松中的應用。
[0019]本發明的優點和積極效果是，基于Runx2轉錄活性上調的抗骨質疏松化合物的發現具有新穎性，本發明首次闡述了所述化合物N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑-3-甲酰胺在骨質疏松防治中的作用，在國內外尚屬首次，對我國開發具有自主知識產權的抗骨質疏松藥物具有現實意義。
【附圖說明】
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[0020]圖1:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺上調模型中Runx2表達效應
[0021]其中:縱坐標-Runx2表達效應上調率)；
[0022]橫坐標-N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2-唑_3_甲酰胺的濃度
[0023]圖2:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺上調MC3T3-E1細胞中Runx2的蛋白水平
[0024]圖3:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2_唑-3-甲酰胺上調細胞內堿性磷酸酶ALP的活性
[0025]圖4:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺增加鈣化結節的數巨
[0026]圖5:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1,2-唑-3-甲酰胺上調細胞內Alp，Opn，Runx2 的 mRNA 水平
[0027]圖6:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)_1，2_唑_3_甲酰胺抑制破骨細胞形成圖7:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺增加鈣化結節的數目圖8:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺上調細胞內Alp，Ορη，
Runx2的mRNA水平
圖9:N-(環丙基甲基)-5-(噻吩-2-基)-1，2-唑-3-甲酰胺抑制破骨細胞形成【具體實施方式】:
[0028]以下實施例可以使專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0029]《實施例1》上調Runx2轉錄活性細胞篩選模型的構建及上調劑的發現
[0030]用于篩選的化合物源自但不限于國家新藥(微生物)篩選實驗室，將其溶于DMSO配置成20mM保存。通過Runx2轉錄活性上調劑細胞篩選模型構建、化合物篩選和熒光檢測等步驟，觀察化合物對模型中Runx2轉錄活性的影響。具體操作如下i
[0031]模型構建:
[0032](I)質粒的構建
[0033]根據p60SE2 質粒[Geoffroy V, et al J B1l Chem, 1995, 270 (52): 30973 - 9.](如圖1)的信息，設計了引物以擴增P60SE2質粒6個重復的Runx2結合元件(60SE2)和下游的最小骨鈣素啟動子片段，并在引物上添加酶切序列。引物序列如下:0SE:正向引物(5’含 Xho I 酶切序列):5，-ccgctcgaggctgcaatcaccaaccac_3，(SEQ ID N0.1);反向引物(5，含 Hind III酶切序列):5，-cccaagcttttgtctgtctgcaccctc-3’ (SEQ ID N0.2)。PCR 結果顯示，利用該引物能擴增獲得靶片段，并且特異性很好，條帶單一。因而直接將PCR產物用PCR純化試劑盒進行提純，最后用20 μ I去離子水將產物從柱子上洗脫下來。將所有產物用Xho I和Hind III雙酶切過夜。載體pGL4.17(購自promega)同樣用Xho I和Hind III雙酶切過夜。次日，將酶切產物跑膠回收。將獲得的插入片斷與線性PGL4.17載體按照摩爾數比3:1在T4DNA Ligase作用下進行連接，16°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH_5a感受態，于含有氨芐青霉素LB培養板上培養過夜。次日，挑選單克隆，擴增培養并提取質粒，所得重組質粒PGL4.17-0SE用Xho I和Hind III雙酶切的方法鑒定。結果如圖2，獲得3個重組質粒#4，#7，#14。
[0034](2)瞬時轉染重組質粒及熒光測定
[0035]分別將pGL4.17、p60SE2、重組質粒#4、#7和#14在96孔板進行轉染，轉染時，用10 4 1/孔0?^-1^11(購自英濰捷基(上海)貿易有限公司)培養基稀釋200ng DNA, 10 μ I/孔opt1-MEM培養基稀釋0.5μ1 origene轉染試劑(購自美國Origene公司)，室溫孵育5min后與稀釋的DNA合并混勻，并繼續孵育20min。取處于生長對數期的MC3T3-E1細胞(購自中國醫學科學院基礎醫學研宄所細胞培養中心)用胰酶消化后，加入含10% FBS的培養基適量，輕輕吹打制成單細胞懸液，并調整細胞濃度為2X 1