一種草親魚用發酵中藥微生物制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種中藥微生物制劑，具體的說是一種草親魚用發酵中藥微生物制劑 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 草魚是我國的主要淡水養殖經濟魚類，是我國"四大家魚"之一，肉質鮮美，生長 快，餌料要求低，深受消費者喜愛。草魚性成熟年齡在4-7齡，性成熟期長，優質的草親魚 是苗種生產單位的寶貴資源，草親魚在產卵過程中，機械損傷和親魚繁殖過程中體力的過 分消耗引起的生理性的體質虛弱，是造成草親魚產后抗病力降低、死亡率高的主要原因。我 國大部分魚苗繁殖場采用草魚一年一次的繁殖方式，產卵量較低，草魚為一年多次產卵類 型，可以在一年中進行兩次甚至三次產卵，利用一年多次催產技術，可以使草魚的產卵量提 高2-3倍，經濟效益非常明顯。但是，草親魚一年多次產卵，二次或三次催產時，正值高溫季 節，草親魚第一次產卵后，營養物質消耗殆盡，不僅需要和正常的一次產卵親魚一樣恢復體 質，而且需要經歷營養積累和性腺再次成熟的過程，且均需在較短的時間內來完成，若營養 補充不能滿足需要或草親魚帶病催產，再次催產后親魚產后由于體質虛弱，傷病等原因造 成的死亡率更高，以及由此間接造成的產卵量、受精率及孵化率降低等問題，隨著催產次數 的增多也更加明顯，這些都給草親魚產前強化培育和產后恢復技術提出了更高的要求。
[0003] 目前主要采用產后注射抗生素，入塘后施用漂白粉或投喂藥餌等化學殺菌劑來預 防和治療產后草親魚死亡問題，具有一定的療效，但耐藥性隨著親魚使用年限的增長日益 突出，并且由此間接造成的受精卵質量低劣、魚苗畸形等問題也不容忽視。采用草親魚產 后注射葡萄糖，入塘后增加嫩草投喂量和補充豆餅、麥芽等精料的方法，對于草親魚產后體 質恢復，具有一定的作用，但恢復期長至20天以上，對于需達到二次催產要求的，恢復和強 化培育期往往長至50-70天以上，影響、縮短了二次孵化魚苗的生長期，魚苗越冬的規格偏 小，直接影響成活率和經濟效益，在我國北方草魚生長期相對較短，使草魚多次產卵技術由 于二次催產日期過晚，變得實際不具有經濟價值。
[0004] 芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等微生物對于改善水質，提高飼料報酬、促進魚類生長、 增強魚類抗病力方面具有顯著的效果，但也存在益生菌數量不穩定、活性低、腸道定植力弱 等缺點。我國傳統中草藥在預防和治療魚類疾病，促進動物性腺發育，產后恢復等方面有廣 泛應用，具有安全、毒副作用小，綠色天然，無藥物殘留等優點，但也存在用藥量大，發苦口 感差，使用麻煩、提取成本高等缺點。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種草親魚用發酵中藥微生物制 劑及其制備方法，所制得的發酵中藥微生物制劑活菌總數多IO8個/g，水分< 10%在飼料中 用量為飼料質量的0. 5-1%。該微生物制劑適用于草親魚，是一年多次產卵的草親魚產前強 化培育、產后迅速恢復體質、提高親魚抗病力和產卵量的發酵中藥微生物制劑。
[0006] -種草親魚用發酵中藥微生物制劑的制備方法，包括以下步驟： 步驟一、微生物的活化和培養：分別將米曲霉、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和產朊假絲 酵母進行活化培養和擴大培養后，得到米曲霉種子液、枯草芽孢桿菌種子液、植物乳桿菌種 子液和產朊假絲酵母種子液，備用；微生物的活化和培養方法分別為： (1)、所述米曲霉的活化培養和擴大培養方法為： a、 活化培養：將米曲霉接入試管固體斜面察氏培養基中，在30°C下培養4-6天，待斜面 長滿黃綠色孢子為止，得到活化培養后米曲霉； 所述察氏培養基，每升培養基中包括硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂0. 5g，氯化鉀 0. 5g，硫酸亞鐵0.0 lg，蔗糖30g和瓊脂20g，余量為水； b、 擴大培養：將米曲霉三角瓶種子擴大培養基混合均勻，粉碎，過4_篩，加入蒸餾水， 使培養基含水量的質量百分比為80-90%，然后取20g含水量的質量百分比為80-90%的米曲 霉三角瓶種子擴大培養基裝入250mL三角瓶中，滅菌后接入2-3環活化培養后米曲霉，置于 30-32°C培養4-5天，制得孢子數在40-80億/g的米曲霉干曲，倒入經事先滅菌過地裝有1% 葡萄糖溶液的三角瓶中，三角瓶中預先裝有數十粒玻璃珠，在搖床上震蕩，充分打散孢子， 調整濃度，使米曲霉孢子數為3-8 X IO7個/mL，即為米曲霉種子液； 所述米曲霉三角瓶種子擴大培養基中各成分的質量百分比為：麩皮80%，面粉10%，豆 餅 10% 〇
[0007] (2)、所述枯草芽孢桿菌的活化培養和擴大培養方法為： a、 活化培養：將保存的枯草芽孢桿菌菌種取出，放入37°C培養箱中4-6小時，接入裝有 50mL牛肉膏蛋白胨培養基的250mL三角瓶中，接種量為1-3接種環；然后搖床轉速200rpm， 37°C培養24小時，得到活化培養后枯草芽孢桿菌； 所述牛肉膏蛋白胨培養基，每升培養基中含有牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，余量 為水，pH 值 7. 2-7. 5 ; b、 擴大培養：取活化培養后枯草芽孢桿菌，按照活化培養后枯草芽孢桿菌和枯草芽 孢桿菌擴大培養基的質量比為1:100的比例，接入裝有50mL枯草芽孢桿菌擴大培養基的 250mL三角瓶中，搖床轉速200rpm，37°C培養24小時，所得培養物中枯草芽孢桿菌數為IO9個/mL ;添加枯草芽孢桿菌擴大培養基調整活菌數使枯草芽孢桿菌數為3-8 X IO8個/mL，即 得到枯草芽孢桿菌種子液； 所述枯草芽孢桿菌擴大培養基，每升培養基中含有玉米粉l〇g，葡萄糖5g，豆餅粉20g， 碳酸媽5g，硫酸按lg，磷酸氫二鉀0. 3g，硫酸鎂0. 2g，水合硫酸猛0. 2g，余量為水，pH值 7. 0-7. 5。
[0008] (3)、所述植物乳桿菌的活化和擴大培養方法為： a、 活化培養：將保存的植物乳桿菌取出，放入37°C培養箱中4-6小時后，接入MRS培養 基中，接種量為1-3接種環，置于5°C靜止培養18-24小時； 所述MRS培養基，每升培養基中含有蛋白陳10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐 溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，硫酸鎂0. 2g，硫酸錳0. 05g，瓊脂 粉15. 0g，余量為水； b、 擴大培養：將活化培養的植物乳桿菌，按照活化培養的植物乳桿菌和植物乳桿菌 擴大培養基的質量比為1:50的比例，接種于植物乳桿菌擴大培養基中，34-37?靜止培養 24h，添加植物乳桿菌擴大培養基調整活菌數使植物乳桿菌數為3-8 X IO8個/mL，即為植物 乳桿菌種子液； 所述植物乳桿菌擴大培養基中各成分的質量百分比為，豆芽汁5%，番茄汁10%，馬鈴薯 5%，蔗糖2%，食鹽4%，水74%。
[0009] (4)、所述產朊假絲酵母的活化和擴大培養方法為： a、 活化培養：將產朊假絲酵母取出放入30°C培養箱中4-6小時，接入事先滅菌的裝有 50mL YH)液體培養基的250mL三角瓶中，接種量為1-3接種環；然后置于30°C，搖床轉速 160 rpm /min，培養18-24小時，得到活化后產朊假絲酵母菌液； 所述YH)液體培養基，每升培養基中含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸膏10g，余量為 水； b、 擴大培養：將活化培養的產朊假絲酵母菌液接種到事先滅菌的裝有50mL產朊假絲 酵母擴大液體培養基的250mL三角瓶中，接種量為產朊假絲酵母擴大液體培養基體積的 2%;然后置于搖床轉速160 rpm /min,溫度30°C條件下培養18-24h后，添加產骯假絲酵母 擴大液體培養基，調整濃度使產朊假絲酵母菌數3-8 X IO8個/mL，得到產朊假絲酵母種子 液； 所述產朊假絲酵母擴大液體培養基：每升培養基中包括葡萄糖l〇〇g，硫酸銨20g，尿素 l〇g，酵母膏2g，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀0. 5g，硫酸鎂I. 2g，余量為水，調整PH值至5. 5 ; 所述米曲霉、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌或產朊假絲酵母的活化培養和擴大培養方法 也可以為，將米曲霉菌粉、枯草芽孢桿菌菌粉、植物乳桿菌菌粉或產朊假絲酵母菌粉，倒入 裝有質量分數為1%葡萄糖水溶液和8-10粒玻璃珠的三角瓶中，在搖床上震蕩，充分打散菌 粉，調整濃度，使米曲霉孢子數為3-8 X IO7個/mL，枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌或產朊假絲酵 母菌數3-8X IO8個/mL，即為米曲霉、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌或產朊假絲酵母菌種子液。
[0010] 步驟二、按照重量份數取中藥，黃芪50-90份，黨參20-40份，白術15-25份，熟地 30-50份，當歸20-40份，白芍10-30份，羊紅膻20-40份，杜仲10-30份，淫羊藿10-30份，菟 絲子10-20份，女貞子20-40份，枸杞子20-40份，陳皮20-40份，谷芽10-30份，茯苓10-20 份，香附10-30份，益母草10-30份和川芎5-15份，除去中藥中的雜質，晾曬，粉碎過40目 篩，混合均勻，得到中藥粉，備用； 所取中藥重量份數，優選為黃芪70-80份，黨參30-35份，白術15-25份，熟地40-45 份，當歸30-35份，白芍20-25份，羊紅膻30-35份，杜仲20-25份，淫羊藿20-25份，菟絲子 15-18份，女貞子30-32份，枸杞子20-40份，陳皮20-40份，谷芽20-25份，茯苓15-18份， 香附10-30份，益母草20-25份和川芎10-12份。
[0011] 步驟三、固體發酵培養基的配制：分別取豆柏粉64