脫細胞生物網膜的制備方法及由其制得的脫細胞生物網膜的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織工程與生物醫用材料技術領域，具體涉及脫細胞生物網膜的制備方法及由其制得的脫細胞生物網膜。
【背景技術】
[0002]細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是結構蛋白和功能蛋白的復雜復合物，包含多種纖維蛋白，如膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖等組分，其組分在不同物種間相對保守。細胞外基質作為細胞生長支架，在細胞粘附、增殖和分化方面發揮著重要作用。在組織工程研宄領域，為了更好的模擬天然細胞外基質的三維微環境，近年來，研宄人員開發了系列通過脫細胞技術得到脫細胞基質生物支架材料的技術與方法。
[0003]脫細胞策略主要是指利用脫細胞技術(物理、化學、酶解等方法)去除組織中各種細胞成分以及遺傳物質從而獲得天然生物支架材料。脫細胞基質材料相對于傳統生物支架材料來說具有諸多優勢，主要包括，I)細胞外基質的三維結構保留完整；2)天然細胞外基質組成成分得以保留，利于細胞生長及功能發揮；3)脫細胞支架材料中含有天然細胞外基質中的細胞因子和信號分子，可以增強細胞的功能并促進生物學功能；4)脫細胞過程能夠降低細胞外基質免疫原性，利于異種來源的組織的治療性應用，擴展了供體的來源；5)脫細胞基質具有生物可降解性，不引發炎性反應。正是由于以上優勢，脫細胞基質生物支架材料研宄近年來得到了國內外研宄人員的廣泛關注并取得系列突破性進展，成功應用于組織工程各個領域。目前，人們已經能夠從多種組織中得到脫細胞基質支架材料，如小腸、皮膚、血管、角膜以及更為復雜心、肺、肝、腎等。
[0004]大網膜是腹膜的一種，是存在于高等動物腹腔中的一層黏膜，是由結締組織形成的膜狀組織。大網膜是連接胃大彎至橫結腸的腹膜。大網膜富有極強的彈性以及高度血管化的結構，這些優點使其在組織工程與再生醫學領域中具有廣泛的應用前景。目前，大網膜脫細胞相關研宄剛剛起步，還存在諸多問題亟待解決。由于大網膜組織的結構和功能與皮膚、血管、瓣膜等組織存在較大差別，傳統的脫細胞方法，如反復凍融法、表面活性劑法、酶消化法等不能完全適用于大網膜組織的脫細胞處理。并且方法步驟繁瑣，成本高，不適用于批量制作。因此，目前需要開發一種能最大程度保留大網膜細胞外基質組成與成分，且方法簡單，成本低廉的大網膜脫細胞方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種操作方法簡單、成本低廉的大網膜脫細胞方法。利用該方法得到大網膜脫細胞基質能夠保留大網膜細胞外基質組成與成分，具有良好的生物相容性。
[0006]根據本發明的一個方面，提供了脫細胞生物網膜的制備方法，其包括使用含十二烷基硫酸鈉與DNA酶的緩沖液浸泡大網膜進行脫細胞處理的步驟。
[0007]根據本發明的另一方面，提供了脫細胞生物網膜的制備方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行:
[0008](I)脫脂溶液的配制
[0009]將甲醇、氯仿與乙醚以體積比為1:1: 0.2-1的比例混勻；
[0010](2)脫細胞液的配制
[0011]I)脫細胞液1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為1.5-3.5%重量比，DNA酶在磷酸鹽緩沖液中的濃度為 3500-4500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0012]2)脫細胞液I1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.6-1.5%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為2500-3500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0013]3)脫細胞液II1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.1-0.6%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為1500-2500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0014](3)大網膜脫細胞處理
[0015]I)取新鮮的大網膜組織，于磷酸鹽緩沖液中清洗，將清洗后的組織震蕩浸泡于所述脫脂溶液中處理，脫脂溶液浸泡時間為18-30h，震蕩頻率為150-250r/min ；
[0016]2)將去除脂肪的所述大網膜組織于磷酸鹽緩沖液中清洗，并震蕩浸泡于所述脫細胞液I中處理，浸泡時間為4-12h，震蕩頻率為100-200r/min ；
[0017]3)將經脫細胞液I處理后的所述大網膜組織于磷酸鹽緩沖液中清洗，并震蕩浸泡于脫細胞液II中處理，浸泡時間為4-12h，震蕩頻率為100-200r/min ；
[0018]4)將經脫細胞液II處理后的大網膜組織于磷酸鹽緩沖液中清洗，并震蕩浸泡于所述脫細胞液III中處理，浸泡時間為4-12h，震蕩頻率為100-200r/min ；
[0019]5)將經脫細胞液III處理后的所述大網膜組織經冷凍干燥后滅菌。
[0020]本發明的方法采用梯度洗脫與物理震蕩相結合的方法對大網膜進行脫細胞處理，與現有的脫細胞方法相比，本發明的方法條件溫和，提高了大網膜脫細胞效率，同時最大程度的保留了大網膜脫細胞基質的組成；本方法還具有操作簡單、可實施性強的優點。
[0021]根據本發明的另一方面，提供了根據上述方法獲得的脫細胞生物網膜。
【附圖說明】
[0022]圖1脫細胞生物網膜I型膠原免疫組織化學染色X200。
[0023]圖2脫細胞生物網膜IV型膠原免疫組織化學染色X 200。
[0024]圖3脫細胞生物網膜纖維連接蛋白疫組織化學染色X200。
[0025]圖4脫細胞生物網膜彈性蛋白疫組織化學染色X200。
[0026]圖5天然大網膜組織與脫細胞生物網膜中的DNA含量檢測(*p < 0.01)。
【具體實施方式】
[0027]在本申請中，縮寫詞的含義如下:
[0028]SDS:十二烷基硫酸鈉；
[0029]PBS:磷酸鹽緩沖液；
[0030]DNA酶:脫氧核糖核酸酶；
[0031]min:分鐘。
[0032]根據本發明的一個方面，提供了脫細胞生物網膜的制備方法，其包括使用含十二烷基硫酸鈉與DNA酶的緩沖液浸泡大網膜進行脫細胞處理的步驟。
[0033]在某些實施方案中，在進行脫細胞處理的步驟中還進行震蕩。
[0034]在某些實施方案中，還包括脫脂處理的步驟。在示例性實施方案中，脫脂處理的步驟在脫細胞處理的步驟之前進行。在某些優選的實施方案中，該脫脂處理的步驟使用體積比為1:1: 0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液進行。在某些更優選的實施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的體積比為1:1: 0.4-0.7。在最優選的實施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的體積比為1:1: 0.5。
[0035]在某些實施方案中，脫細胞處理的步驟是分梯度進行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。
[0036]在某些優選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.5-3.5%重量比，DNA酶的濃度為3500-4500U/L，pH為7.2-7.4。在某些更優選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.5-2.5%重量比，DNA酶的濃度為3600-4400U/L。在某些更優選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.8-2.2%重量比，DNA酶的濃度為3800-4200U/L。在最優選的實施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為2.0 %重量比，DNA酶的濃度為4000U/L。
[0037]在某些優選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.6-1.5%重量比，DNA酶的濃度為2500-3500U/L，pH為7.2-7.4。在某些更優選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.7-1.3%重量比，DNA酶的濃度為2600-3400U/L。在某些更優選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.8-1.2%重量比，DNA酶的濃度為2800-3200U/L。在最優選的實施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1.0 %重量比，DNA酶的濃度為3000U/L。
[0038]在某些優選的實施方案中，所述梯度還包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.1-0.6%重量比，DNA酶的濃度為1500-2500U/L，pH為7.2-7.4。在某些更優選的實施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.2-0.6%重量比，DNA酶的濃度為1600-2400U/L。在某些更優選的實施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.4-0.6%重量比，DNA酶的濃度為1800-2200U/L。在最優選的實施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸鈉的濃度為0.5%重量比，DNA酶的濃度為2000U/L。
[0039]根據本發明的另一方面，提供了脫細胞生物網膜的制備方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行:
[0040](I)脫脂溶液的配制
[0041]將甲醇、氯仿與乙醚以體積比為1:1: 0.2-1的比例混勻；
[0042](2)脫細胞液的配制
[0043]I)脫細胞液1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為1.5-3.5%重量比，DNA酶在磷酸鹽緩沖液中的濃度為 3500-4500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0044]2)脫細胞液I1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.6-1.5%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為2500-3500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0045]3)脫細胞液II1:稱取十二烷基硫酸鈉及DNA酶，溶解于磷酸鹽緩沖液中，其中，十二烷基硫酸鈉在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.1-0.6%重量比，DNA酶在PBS中的濃度為1500-2500U/L，pH 為 7.2-7.4，過濾除菌；
[0046](3)大網膜脫細胞處理
[0047]I)取新鮮的大網膜組織，于磷酸鹽緩沖液中清洗，將清洗后的組織震蕩浸泡于所述脫脂溶液中處理，脫脂溶液浸泡時間為18-30h，震蕩頻率為150-250r